免疫电镜技术bySun
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概述
免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术（immunocytochemistry），是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。
免疫电镜技术的操作程序
抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。
抗体的制备
特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。
标本的处理
为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。
- 取材
单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。
组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm×2 mm×l mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。
- 固定
固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的固定方法。
- 常用的免疫电镜标本固定液
多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为4～5 h。对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。
过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。因为赖氨酸价格较贵，此固定液不如PG固定液经济。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH为7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，改善对膜和胞质的保存。特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。
- 固定方法与时间
灌注固定：这是固定效果最好的方式，能使超微结构得到很好的保存。以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液，静脉压为120mm Hg柱，在5～15 min内每200g体重灌注150 ml固定液。
浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定时间常为2～5h，游离细胞固定0.5～1h。
- 包埋
包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果，一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。
包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。这三种包埋剂均能在低温下（-35℃～-80℃）用紫外光（波长315～360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。
免疫标记
根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。这三种免疫标记方法，都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。
- 包埋前免疫标记
优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有利于膜结构的保存。
包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施：
•厚切片
厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。厚切片的方法有以下几种：
冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定程度上影响标记的阳性率。
震动切片：震动切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫电镜用只需20μm～80μm的切片。震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深层的组织就不易被标记。
•增加细胞膜的通透性
用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性剂处理5～8min，以增加细胞膜的通透性。但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。也可用冻融的方法增加细胞膜通透性，标本先进行防冰晶处理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振摇沉底），在液氮中速冻0.5～1min后用PBS迅速回温。
•选用相对分子质量较小的标记物
辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物，分子质量较小，约100kD，较易进入细胞内。也可用IgG Fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精确定位。
- 包埋后免疫标记
包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常常避免使用。为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率，必须注意以下几个方面：
•通过预实验确定合适的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到较好的超微结构。固定液一般不用四氧化锇，因其会使抗原活性明显降低。
•选用低温包埋剂。
•免疫电镜用载网要选用镍网或金网，而不用铜网，因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。
- 冷冻超薄切片免疫标记
冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。1996年，LiouW等改良了冷冻超薄切片技术，用甲基纤维素和醋酸铀混合液（含1.5％～2％甲基纤维素，0.3％～3％醋酸铀的水溶液）代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液，得到了保存良好的超微结构，使该项技术更加完美，应用也越来越广泛。但该项技术必须有特殊的冷冻超薄切片机，且技术难度较高。
对照实验
为了证实免疫标记结果的特异性，必须同时进行对照实验。在抗体的特异性无问题的前提下，对照实验有以下几种：
•用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体，结果应为阴性。 •不加一抗，结果应为阴性。 •用不含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阴性。 •对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阳性。
结果的观察和解析
在电镜下观察免疫标记的结果，通过标记物（胶体金、铁蛋白或酶底物）显示免疫反应部位以定位抗原的存在位置，注意区分特异性标记和背景的非特异性标记，进行正确的结果分析。
胶体金标记免疫电镜技术
胶体金的制备
胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，颗粒之间的静电排斥力使它们在水溶液中保持溶胶状态。胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金溶液呈紫红色。氯金酸（HAuCl4）水溶液在还原剂作用下可产生单分散的胶体金颗粒。在还原开始阶段，金离子被还原成金原子并聚集形成微结晶，随着更多的氯化金被还原，微结晶变大直到所有的氯化金被还原。还原剂的种类和浓度决定了结晶核形成与结晶核生长之间的比率，因而决定了颗粒的最终大小。通过改变还原剂的种类与浓度，可以制备不同大小（1～150nm）的金颗粒。还原剂浓度越高，胶体金颗粒直径越小（注：用于制备胶体金的玻璃器皿必须非常洁净）。现常采用的胶体金制备方法主要有以下几种：柠檬酸三钠还原法（15nm，Frens，l973年），鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm，Slot，l985年），1 mol/L硫氰酸钠还原法（2.8nm，Bashong W，1985年）。胶体金会随着放置时间的延长而聚集，因此必须在3天内使用完。
胶体金标记蛋白质的制备
胶体金能标记很多大分子，例如免疫球蛋白、蛋白A、凝集素、酶、毒素、脂蛋白等。胶体金是一种带负电荷的疏水胶，其颗粒表面不仅带负电荷，而且表现出疏水的特性。在与蛋白质结合的时候，必须将胶体金的pH值调至被标记蛋白质的等电点略偏碱（高于蛋白质等电点0.5），这样就能在保持疏水作用力的同时防止由于静电吸引所致的蛋白质聚集，促进蛋白质与胶体金的结合。吸附后蛋白的生物活性不变，大分子的吸附使金颗粒变得稳定，成为一种亲水胶体，并可保持数月或数年之久。
- 待标记蛋白质和金溶胶的处理
长期低温保存的蛋白质很容易形成聚集物，这些聚集物会影响标记过程及胶体金探针的稳定性，因此在标记前必须经微孔滤膜过滤或离心（100,000 g，4℃，60 min）以除去聚集物。蛋白质在低盐和略高于等电点的pH（高于等电点0.5）条件下才能与胶体金稳定结合，因此在制备胶体金标记蛋白质探针前必须将蛋白质进行处理。用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mo1/L HCl将金溶胶的pH调至待标记蛋白质的等电点略偏碱（值高于蛋白质等电点0.5）
- 确定稳定胶体金所需的蛋白质的量
将l ml胶体金加入到含0.1 ml逐级稀释（5～40ug）的蛋白质的试管中，混匀 后静置10 min，然后在每管中加入0.1 ml 10％NaCl。若加入的蛋白质的量不足以稳定胶体金，液体的颜色就会由红变蓝；而当蛋白质的量达到最低稳定量时，液体的颜色则保持红色不变，在此基础上再加10％的量即为稳定每毫升胶体金所需的蛋白质的实际用量。在测量用鞣酸制备的胶体金的蛋白结合量时，必须先在胶体金中加入0.1％ H2O2，以便能裸眼观察到溶液颜色的改变。若裸眼不能观察到溶液颜色的变化，可以通过测定510～550 nm吸收值来定量。
- 胶体金与蛋白质偶联
在磁力搅拌下，将10 ml胶体金加入到0.2 ml蛋白质溶液中，混匀后静置10 min。加入1％PEG使其最终浓度为0.04％以增强探针的稳定性，也可加入牛血清白蛋白（BSA）水溶液，使其终浓度为1％～5％，同样可达到稳定探针的目的。若想一批制备大量的胶体金探针，则应分成数次偶联，每次仍以10 ml胶体金为宜。
- 胶体金标记蛋白质探针的纯化
纯化方法有两种： •超离心法：超离心法简便易行，让胶体金标记蛋白质探针再静置30 min后用普通离心机离心（3,000 rpm，15～20 min），取上清进行超速离心（60,000×g，45 min），去上清，用1.5 ml含0.04％PEG的PBS重悬疏松的红色沉淀物。底部硬的沉淀物为未与蛋白质结合的金颗粒。金探针通常贮存在4℃条件下，有效期为6个月，也可在金探针中加入等量的甘油-20℃保存。使用时，用含0.02％PEG的PBS将金探针稀释10～20倍。
•凝胶过滤法：纯化的胶体金探针必须以BSA作为稳定剂。将胶体金标记蛋白质探针装入透析袋内，置硅胶或PEG中浓缩至原体积的1/10左右。用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液离心（15,000rpm，15 min）。取上清加到Sephacryl S-400层析柱上分离纯化，加样体积为柱体积的1/10。用0.02mol/L TBS（含0.1％BSA；0.05％NaN3；pH为8.2用于IgG-胶体金，pH为7.0用于蛋白A-胶体金）洗脱，流速为8 ml/h，按红色深浅分管收集洗脱液（每管2ml）。先滤出的液体呈淡红色，内含大颗粒聚集物，纯化的金探针滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明。
- 胶体金标记抗体探针制备
•透析抗体：抗体先用0.2mol/L硼酸-氯化钠缓冲液（pH9.0）透析过夜，再用2mmol/L硼酸-氯化钠缓冲液（pH 9.0）透析2h。注意抗体在2mmol/L硼酸-氯化钠缓冲液中停留时间太长会凝集。
•确定稳定胶体金所需的抗体量，若抗体量有限，用100μl的胶体金和10μl逐级稀释的抗体及相应浓度的NaCl溶液来定量。
•在磁力搅拌下，将胶体金加入到抗体中，混匀后静置10～30min，加入明胶（37℃，45％冷水鱼明胶）使其终浓度为1％，以稳定金探针。
•蔗糖梯度离心纯化金探针2次。在一离心管中依次铺上0.5ml 100％蔗糖，1 ml 60％、l ml 40％、1ml 20％蔗糖溶液（用含1％冷水鱼明胶的TBS配制），立即将其置于冰上。加入胶体金探针，离心（200,000×g，4℃，lh）。去上清，收集红色疏松沉淀物，用1～2ml TBS稀释，在室温下用TBS透析1h以除去蔗糖。重复上述离心1次，去上清，收集红色疏松沉淀物，用1～2ml TBS稀释后在室温下用TBS透析1h以除去蔗糖。用含1％冷水鱼明胶的TBS稀释所得到的金探针，4℃条件下保存。用冷水鱼明胶代替BSA作为金探针的稳定剂，可以降低非特异性反应。
- 胶体金标记蛋白A探针制备
金黄色葡萄球菌蛋白A（protein A）能与数种哺乳动物IgG分子的Fc段结合，这一特性已使蛋白A作为免疫组织化学和免疫细胞化学技术中的第二试剂在光镜和电镜中得到广泛应用。除了蛋白A外，目前还有另外三种能结合免疫球蛋白的蛋白：蛋白G、蛋白L和蛋白LA。蛋白G来源于C型链球菌，也能与哺乳动物IgG分子的Fc段结合，其结合谱比蛋白A更广。蛋白L和蛋白LA为重组蛋白，蛋白L含4个Ig的κ轻链的结合位点。蛋白LA是一种新型杂交蛋白。含4个IgG的Fc结合区（蛋白A）和4个Ig的κ轻链的结合位点（蛋白L），因此能与非常多的哺乳动物工Ig分子结合。在免疫电镜标记时，可根据第一抗体的种类选择恰当的结合蛋白。
•用0.1 mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl将金溶胶的pH调至6.0。在磁力搅拌下，将10 ml胶体金加入到0.2ml蛋白A溶液中（含0.3 mg蛋白A，15nm胶体金），混匀后静置10min，加入1％PEG使其最终浓度为0.04％。 •蛋白A-胶体金探针再静置30min， 3000 rpm离心15～20min，上清超速离心（60,000×g，45min），去上清，用1.5ml含0.04％PEG的PBS重悬疏松的红色沉淀物。4℃条件下保存，有效期为6个月。
胶体金探针的质量鉴定
胶体金颗粒透射电镜测定：在覆有碳-formvar膜的载网上滴一滴胶体金，l～2 min后，用滤纸吸去过多的胶体金，空气干燥后在透射电镜下观察并测量金颗粒的直径。
滤纸模型或硝酸纤维纸模型免疫细胞化学标记鉴定：在宽0.8 cm滤纸或硝酸纤维膜上自上而下分别滴2μl逐级稀释的抗原（1.8～1800 pmol/2ul），另加3条作为对照条。 •将含抗原的滤纸放在密闭的容器中，用多聚甲醛蒸气（80℃）固定1 h，然后进行免疫标记： •用0.05 mol/L TBS（pH 7.4）浸湿。 •用1：5稀释的正常血清（与一抗同种的动物血清）室温湿盒内孵育10min。 •用不同稀释比例的一抗各孵育一条滤纸，室温湿盒内孵育1h。 •用0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗3次，每次5min。0.02 mol/L TBS（含0.1％BSA，pH7.4）洗5 min。 •用适当稀释的胶体金探针（1：10～l：20）室温湿盒内孵育30min。 •用0.02 mol/L TBS（含0.1％BSA，pH 7.4）洗5 min，0.05 mol/L TBS（pH7.4）洗3次，每次5 min。 •去离子蒸馏水洗5次，每次5 min。 •银显影液显色3～5 min。 •去离子蒸馏水洗5次，每次5min，晾干后肉眼观察。 •对照组1、2、3分别为以TBS代替抗原、以正常血清代替一抗和省去二抗。 结果：阳性染色最深而背景最浅的为最佳一抗和二抗的稀释度，对照组应为阴性。
分光光度计测定A值：胶体金的吸收峰在510～550 nm之间，颗粒越大吸收波长也越大，测520 nm的A值可计算胶体金生产质量。超离心纯化的胶体金标记抗体稀释至1：20时，A520nm值为0.25，一般电镜免疫胶体金标记时，将胶体金探针稀释至A520nm值为0.2～0.4。凝胶过滤法纯化的胶体金探针，不同收集管中的浓度不一，应按实际浓度稀释使用。
铁蛋白标记免疫电镜技术
铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法仍然是一种基本技术。
基本原理
铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。
铁蛋白的提取和纯化
铁蛋白来自许多动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高，标记用的铁蛋白主要是从马脾脏中提取。取健康的马脾，去除脾外的淋巴结和脂肪组织，按湿重1：1.5加入蒸馏水，将组织匀浆，置水浴中加热至80℃使铁蛋白以外的蛋白质变性，冷却后用两层纱布过滤，滤液离心（7000rpm，20 min），取棕红色上清液，每100mL上清液中加入35g硫酸铵，充分搅拌使铁蛋白沉淀析出，4℃过夜，离心（3000rpm，30min）后取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水，4℃对水透析除去硫酸铵。加入硫酸镉（5g/100 mL）置4℃ 40h使铁蛋白结晶，然后离心（1000 rpm，30min），取沉淀于底部的棕色铁蛋白结晶。将铁蛋白晶粒溶于少量2％硫酸铵中（pH5.9），离心（1000 rpm，30min），将棕红色上清用硫酸镉重复结晶6次。再将重结晶溶于75mL 2％硫酸铵（pH5.9）溶液中，用等体积饱和硫酸铵重复沉淀3次，然后将沉淀溶于少量蒸馏水中，4℃对水透析去掉硫酸铵，再用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）透析8h即为铁蛋白提取物。
铁蛋白现在已经有商品供应，商品铁蛋白含量为10％，保存在4℃冰箱中。产品含蛋白酶等杂质，使用前需进行纯化，方法如下： •取1mL商品铁蛋白溶液，用1000mL蒸馏水或1％的氯化钠溶液透析3次，去除重结晶过程中残留在铁蛋白中的硫酸镉。 •200 rpm离心10 min，去除大的聚合物。 •3000rpm离心1～2h，使其形成铁蛋白小球，弃上清。 •用结合反应所用的缓冲液悬浮沉淀。 •马脾铁蛋白约含15％的低聚物，为除去这些杂质，将铁蛋白溶液过4B柱，收集流出液，取后2/3峰再过一次4B柱，可获得98％的单体铁蛋白。 •用50％的饱和硫酸铵使铁蛋白沉淀，然后将沉淀溶于少量蒸馏水中，通过透析去除硫酸铵。
铁蛋白的鉴定
光镜检查取6次重结晶后的铁蛋白晶体，置载玻片上加盖玻片观察。可见铁蛋白晶体呈金黄色或棕黄色四面体或八面体。
电镜检查将铁蛋白水溶液滴在覆有支持膜的铜网上，用3％磷钨酸负染色，在透射电镜下观察。可见铁蛋白分子为含4个电子致密区的球形蛋白分子，外被蛋白外壳，直径10～12nm，内核7.5 nm。
抗体和铁蛋白的结合
利用一些具有双功能基团的偶联剂，使铁蛋白和抗体分子偶联成为标记抗体，叫铁蛋白标记物。能使铁蛋白和抗体分子结合的偶联剂有：2,4-甲苯二异氰酸盐[TC,(toluene-2,4-diisocyanate)]、间-二甲苯二异氰酸盐[XC,(m-xylyenediisocyanate)]、对,对-二氟-间-二硝基酚砜[FNPS,(P,P-difluoro-m, m'-dinitrophenolsulfone)]以及戊二醛。近年来，普遍认为戊二醛作为偶联剂效果较好，对抗体活性影响小，标记抗体的产量高。可分为一步法和二步法。
戊二醛一步法: 在0.9 ml的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）中溶解15 mg铁蛋白和3 mg抗体，加入0.1ml戊二醛，在37℃中放置24h，加入0.01mol/L赖氨酸中止反应，反应物加入0.02％NaN3防腐。
戊二醛二步法: 在每毫升0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）中溶解50～80mg铁蛋白，加入戊二醛使其终浓度为0.05～0.15％，在37℃中放置2h后，过G-25柱，去除戊二醛，收集洗脱峰，按抗体/铁蛋白＝1/5的比例，在37℃反应12h，加入0.01mol/L赖氨酸中止反应，反应物加入0.02％NaN3防腐。
铁蛋白标记抗体的纯化
铁蛋白标记抗体后的混合液中含一些未标记的抗体球蛋白、铁蛋白及偶联剂，这样使抗体-铁蛋白偶联物的活性浓度降低，这些杂质需尽量去除。方法是将标记的抗体复合物，在4℃的条件下加入1/3体积的饱和硫酸铵使其饱和度为25％，4000rpm离心15min，上清为未标记的抗体和铁蛋白，废弃。沉淀为棕黄色标记的铁蛋白抗体，将沉淀溶于少量0.1mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2），过G-25柱除盐。
用铁蛋白标记抗体的应用
用抗体-铁蛋白标记细胞表面抗原，具体方法及步骤与用胶体金探针标记细胞表面抗原类似，两者的区别只是所选用的探针不同而已。
酶标记免疫电镜技术
将酶和抗体结合，这种酶-抗体结合物仍然保持酶和抗体的活性及特异性，结合物中的抗体与相应组织或细胞内的抗原特异性结合，形成不溶性复合物，然后通过酶的底物显示酶的活性部位，酶反应产物经过OsO4处理后变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察，从而对抗原进行定位，这种方法叫酶标记免疫电镜技术。目前，用于标记抗体的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、细胞色素C、微过氧化物酶等，但最常用的是HRP，其稳定性好，分子量小（40kD），其标记抗体可以穿透经适当处理的组织与细胞膜，能用于细胞内抗原定位。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高。
辣根过氧化物酶（HRP）
辣根过氧化物酶是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉辅基结合而成的一种糖蛋白，糖类的含量占18%。商品一般在不同程度上含有非酶蛋白。它的纯度用RZ（德文Reinheit Zalt的缩写）来表示。辣根过氧化物酶的辅基在403nm波长下呈最大吸收，通常用OD403nm数值反应酶的含量。酶的蛋白部分在OD275nm下吸收最强。RZ即OD403nm/OD275nm的值。RZ值越小表示非酶蛋白越多。高纯度的酶制品RZ应为3.0左右，最高可达3.4。免疫电镜需用高纯度的酶。酶的纯度与其活性强度不一定平行，所以酶的规格除纯度外，还应包括活性强度。
酶标记抗体法
标记的前提是保留抗体与酶的部分活性，保留越多越好。目前有两类标记法。
双功能剂偶联法：最常用的双功能剂是戊二醛。它的两个醛基能与抗体（或其它蛋白质）和HRP的氨基或羟基结合，而使二者偶联在一起。常用二步标记法，即第一步先使戊二醛的一个醛基与HRP的氨基结合，第二步再使戊二醛的另一个醛基与抗体的氨基结合。用此法所得的HRP-抗体结合物中，HRP与抗体皆为单体，分子量为200kD左右，抗体与酶活性保存60%左右，缺点是结合率不高。戊二醛二步法（AVrameas-Ternyck法，）具体操作步骤为：取辣根过氧化物酶10 mg溶于0.1 mol/L PBS（pH 6.8）中，配成含1.25％戊二醛溶液0.2 ml，室温放置18h。用生理盐水透析或经葡聚糖凝胶G-25除去戊二醛，用生理盐水补充至l ml。加入含5 mg抗体的生理盐水溶液l ml和l mol/L（pH9.5）碳酸盐缓冲液0.1 ml，混匀后在4℃放置24h。 加0.1 ml 0.2 mol/L赖氨酸溶液，室温中放置2h。用半饱和硫酸铵沉淀三次，透析除去硫酸铵，离心（1000 rpm，30min），取上清分装冻存，或加入等量60％甘油的PBS，4℃贮存。用前1 mg蛋白加入1 mg小白鼠肝粉末吸收，除去非特异反应物质。
过碘酸盐氧化标记法：HRP中的氨基含量很少，用戊二醛交联虽方法简便，但结合物产率很低，一般只有2％～5％的酶能结合IgG上。与氨基相反，HRP上的糖蛋白却较多，约18％。糖分子对酶的活性影响不大，但难以直接与抗体的氨基进行反应，所以，用过碘酸钠（NaIO4）使糖进行轻微氧化，产生醛基，后者再与抗体的氨基反应。这样，HRP就能更有效地与抗体结合。将5 mg辣根过氧化物酶溶于l ml 0.3mol/L碳酸氢钠溶液（pH8.1）中，加0.1 ml 1％二硝基氟苯无水乙醇溶液，室温轻轻搅拌1h。加lml 0.04～0.08mol/L过碘酸钠，搅拌30 min后，溶液呈黄绿色。再加l ml0.16mol/L乙二醇，继续搅拌1h。对1000 ml 0.01mol/L（pH9.5）的碳酸盐缓冲液充分透析4℃，其间换缓冲液三次。加入含5mg IgG的碳酸盐缓冲液lml，室温轻搅2～3h。加入5mg NaBH4，置4℃3小时或过夜。对PBS透析24h，4℃离心去沉淀，用半饱和硫酸铵沉淀结合物三次，除铵、分装、保存。
不标记抗体酶法
酶桥法：Mason等（1969年）与Sternberger（1969年）同时报道了免疫球蛋白-酶桥法（又称夹心法或三层法）。其原理主要是利用第二抗体为桥梁，把抗原的特异性抗体与抗HRP抗体结合起来，后者再与HRP结合。HRP与其抗体形成复合物后仍保留其酶活性，可加底物显色，达到定位抗原的目的。由于在抗HRP血清中除酶抗体外，还含有非酶抗体，后者与酶抗体竞争在第二抗体上的结合点，所以抗HRP抗体必须效价高，才能保证此法的高灵敏性。为此要耗费较多的纯HRP来制备抗HRP血清。
PAP法与双PAP法：为了改进酶桥法，Sternberger等人（1970年）又建立了可溶性酶-抗酶 抗体复合物法（简称PAP法）。他们制备了可溶性兔PAP来代替酶桥法中的最后两个步骤，即兔抗HRP抗体与自由HRP两步。此法既可纯化酶抗体以提高方法的灵敏性，又可简化酶桥法繁多的步骤。可溶性兔PAP是大分子的复合物，含有三个分子HRP与两个抗HRP抗体，外形呈五角形，分子量429 kD，直径20.5nm。Vacca等（1980年）提出了双PAP法，既在用PAP处理组织或细胞后，重复使用一次羊抗兔IgG和PAP，最后显色。这样可比单纯的PAP法提高灵敏性4～5倍。在用单克隆抗体做第一抗体定位抗原是，桥抗体需用羊抗鼠IgG取代羊抗兔IgG，兔PAP需用鼠PAP取代。继Terngnek（1983年）之后，程明（1987年）在国内首先制备了鼠PAP，后者是用抗HRP的单抗隆抗体与HRP共育而制成，产物为一个抗体分子结合两个酶分子，分子量比兔PAP小很多。
电镜原位杂交技术
自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来，这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料。近年来该技术的应用领域逐渐扩大，应用一系列放大手段增强检测的灵敏度，提高其分辨率，即向电镜水平发展。
Jacob和Gueskens（1971）首先用3H标记的核酸RNA探针进行电镜水平的DNA原位杂交，分别观察小鼠L929细胞有丝分裂期核的卫星DNA和猴肾培养细胞中的Simian病毒40（SV40），将原位杂交从光镜水平发展到电镜水平。电镜水平原位分子杂交技术，与其他传统分子生物学方法相比，它不仅具有高灵敏度和强特异性的优点，而且定位精确，并可观察细胞的超微结构。它的发展为基础医学、临床疾病的病因、病理机制以及病毒性、肿瘤性疾病的研究提供了重要技术手段。
原位杂交的原理
DNA由两条多核苷酸链组成，两条链之间的碱基按严格的互补规律结合成对。按照碱基配对原则，如果两条核酸单链（DNA，DNA或DNA，RNA）中，一条碱基序列与另一条碱基互补配对，则在一定的条件下，可形成双链复合体。原位杂交技术依据这个原理，利用已知的核苷酸序列DNA片段作为探针，按照碱基配对的互补原则去识别细胞中靶DNA和RNA，并与之特异性结合。由于碱基是严格配对的，所以一种DNA探针只能与待检测标本的互补DNA或RNA结合。因此，已标记（如核素、生物素或地高辛）的DNA探针与标本的DNA或RNA原位杂交，再应用放射自显影或胶体金、HRP等示踪，从而达到研究的目的。
探针的种类
核酸探针根据是否具有放射性可分为两大类：放射性探针和非放射性探针。根据核酸性质又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针及寡核苷酸探针等。探针长度通常以50～200个碱基为宜，这一长度兼顾穿透性和灵敏度的技术要求。在实验中应根据不同实验对象选择合适的探针，如某些特殊的实验，探针可长达2kb。现分别介绍几种常用核酸探针的特点。
•单链DNA探针 将cDNA导入M13衍生载体中，可产生大量的单链DNA，用于标记 单链DNA探针，探针不需要变性，提高了杂交反应的灵敏度。
•双链cDNA探针 制备cDNA探针，首先要从细胞内分离出mRNA，然后通过逆转录合成cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA分子。cDNA片段可应用缺口翻译法或引物延伸法标记放射性核素或生物素等。
•寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成探针， 其方法简便。人工合成寡聚DNA片段长度为20～50个碱基，过短易造成假阳性，过长则杂交阳性率降低。寡核苷酸探针，可用5'端标记法，3'端标记法或引物延伸法进行标记。放射性核素或非放射性标记物均可应用于寡核苷酸探针标记。
•RNA探针 将目的基因cDNA片段插入到含有特异的RNA聚合酶启动子序列（如大肠杆菌T9、噬菌体T4或鼠伤寒杆菌噬菌体SP6）的质粒中，随后再将重组质粒扩增、纯化，用限制酶将质粒模板切割，使之线性化。在RNA酶的作用下，从启动子部位开始，以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应物中要有放射性核素或非放射性标记核苷酸原料的存在，经过体外转录后即可获得标记的单链RNA探针。
探针的标记
探针的标记方法较多，通常可分为放射性核素标记和非放射性核素标记两大类。后者主要有生物素标记探针、地高辛标记探针等。
•核素标记探针 原位杂交早期就应用放射性核素3H做标记物，发展至今核素标记核酸探针得到了广泛的应用。由于不同放射性核素半衰期、β射线的最大能量以及标记探针的比活性不同，故标记探针的稳定性、原位杂交的敏感性以及放射自显影的曝光时间也各不相同。
•生物素标记探针 利用生物素与亲和素的专一、迅速和稳定结合的特点标记核酸探针。亲和素是一种碱性的四聚体糖蛋白（68,000，pI10.5），每个亚基都能结合1个生物素分子。活化的生物素能与蛋白质、糖类或核酸等物质偶联，当带有标记物的亲和素与偶联的生物素结合后，与生物素偶联的物质即可被显示。标记生物素的核酸探针应用于电镜原位杂交的链酶亲和素、光敏生物素和胶体金示踪系统。非核素标记的探针已有替代放射性核素标记的探针的趋势，广泛应用于DNA序列测定、重组质粒的筛选、细胞遗传学的分析、临床诊断等方面。
•地高辛标记探针 地高辛标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针，杂交体再用特异性抗地高辛抗体通过免疫组织化学技术检测。在适宜的标记反应条件下，一般每20～25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。这一标记长度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛之间的反应，因为1个标记抗体大约覆盖20个核苷酸。宝灵曼公司的地高辛标记核苷酸有dig-UTP和dig-ddUTP等，适用于RNA探针、DNA探针和寡核苷酸探针，其试剂盒用抗地高辛-金和银增强示踪。由于探针敏感性与放射性核素相当，探针保存时间长，对环境无污染，既可用于光镜，又可应用于电镜示踪，目前地高辛原位杂交试剂盒已得到较多的应用。
•多重标记探针 多重标记就是在一次实验中使用多种不同的探针进行标记及检测。电镜原位杂交的多重示踪系统可应用不同大小的胶体金进行亚细胞的精确定位。多重标记在理论上是可行的，但在实际工作中其相互干扰、人工假像等问题不可忽视。
常用的探针标记技术
•DNA探针的缺口翻译法 胰DNA酶I可将DNA双链随机切开，而DNA聚合酶以互补DNA链为模板按5'→3'方向，用外加已标记的三磷酸核苷酸，修复缺口，重新合成带标记物的DNA双链。如果外加的是生物素或核素标记的脱氧核苷酸，经纯化便形成生物素或核素标记的DNA探针。
•直接标记法 光敏生物素是一种可用光照活化的的生物素衍生物，在水溶液中将光敏生物素与待标记之核酸混合，用光照射，可与单链或双链的DNA、RNA形成共价结合的探针。该法简便、重复性好、不需核酸合成酶等。
•随机引物延伸法 随机引物K4M为人工合成的6～12个核苷酸的单链DNA，它在标记过程中充当引物。同时此方法的DNA聚合酶I的片段（Klenow），不含5'→3'核酸外切酶活性，避免DNA合成后的再降解。目前有多种随机引物标记盒市售。
•RNA探针的DNA体外转录法 在质粒载体上结合SP6、T9或T3强启动子，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow法酸式T4噬菌体DNA聚合酶在4种dNTP存在下，体外合成RNA，转录在线性DNA分子末端终止。新合成标记RNA数量取决于线性DNA的量、大小、位点以及模板DNA的纯度。
•寡核苷酸3'端标记法 寡核苷酸可以在其3'端用末端转移酶掺入标记的DIG-ddUTP，或DIG-dUTP经聚丙烯酰胺凝胶过滤纯化的寡核苷酸长度为12～100bp。此外，PCR可扩增特异DNA片段，也可将32P-dNTP等标记物结合到DNA中，从而达到示踪的目的。
电镜原位杂交的注意事项
•固定：新鲜标本要及时固定，为了保存组织中的RNA不被降解，又要保存良好的亚细胞结构形态，电镜原位杂交多采用多聚甲醛-戊二醛混合固定液。锇酸是电镜样品制备的常用固定剂，它有利于膜性结构的保存，却不利于组织结构细胞内RNA的保存，可在杂交完成后应用。通常在采用包埋前原位杂交时使用为宜。
•杂交前处理：在杂交前为了使探针和胶体金容易进入细胞，一般认为组织细胞标本在杂交前应用蛋白酶K或去垢剂处理，可增加探针对靶核酸的通透性，提高杂交效率。但也有学者认为：蛋白酶K消化不仅没有起到良好的作用，相反造成RNA的降解、丢失。电镜超薄切片原位杂交中应尽量避免用蛋白酶K和Triton X-100处理，必要时可采用低浓度的蛋白酶K和Triton X-100作杂交前处理，因为若使用的蛋白酶K和Triton X-100浓度不当，组织切片易破碎或被消化。
•变性及杂交反应：电镜原位杂交与光镜原位杂交的反应条件基本相同，但二者在变性、杂交反应温度上略有不同，其后续的处理程序也不尽相同。如光镜杂交变性的温度一般在90℃以上处理10min，骤冷复性后，组织在42℃杂交反应液中进行长达24～48h孵育完成。而电镜杂交的变性温度一般则控制在70℃左右，杂交反应温度一般在37℃ 10～20h。如变性温度过高，孵育时间过长，亚细胞结构将受到一定程度的破坏；温度过低达不到变性的效果，从而影响核酸探针杂交信号的显现。为了获得良好的亚细胞结构，又要保证杂交的灵敏度，及电镜杂交最宜条件摸索，有待于在实际工作中进一步积累经验。
•杂交结果的显示电镜原位杂交的示踪系统必须具有电子致密物的特性，才能在电镜下观察结果。非放射性标记探针电镜原位杂交的杂交体大多用免疫组织化学技术检测。各种电镜免疫组织化学技术如免疫酶、胶体金等都可用于电镜原位杂交。胶体金技术的发展不但为免疫电镜，而且也为电镜原位杂交提供了很好的示踪物。由于胶体金 电子密度高，形态规则，金颗粒直径可以人为控制（5～150nm），容易制备，安全无毒性。因此，金标蛋白A、金标羊抗兔IgG和金标链霉亲和素等胶体金试剂已被广泛用于电镜原位杂交技术。
•低温包埋剂的使用：用低温包埋剂进行原位杂交，可以提高原位杂交的成功率。
免疫电镜应用举例
胶体金标记免疫电镜
- 包埋前胶体金标记免疫电镜
胶体金探针（>3nm）即使在使用穿透剂的情况下也不易穿透细胞，因此常常用于细胞表面抗原的标记。20世纪90年代，国外成功制备了1nm金标记的探针，这种探针容易穿透组织和细胞，已成功应用于标记细胞内抗原。包埋前免疫标记时，在标本未作固定或轻微固定后进行免疫标记，标记后再用2％戊二醛+2％多聚甲醛固定以获得较好的超微结构保存。这种方法特别适用于标记对固定剂敏感的抗原。在标记细胞膜表面成分时，应注意免疫标记可能会引起细胞膜成分的重分布，抗体与未固定或轻微固定的细胞膜成分的结合可能会引起这些分子的聚集、成帽或内吞。通常用含低浓度戊二醛的固定液作短暂固定，能有效防止膜分子的重分布。单独用多聚甲醛固定或在4℃做免疫标记不足以防止质膜分子向周边扩散。
细胞表面抗原标记（间接法）
•细胞用PBS洗两次，用0.5％戊二醛+2％多聚甲醛在室温下固定0.5～lh。可根据抗原对固定剂的敏感度选择恰当的固定液，对某些抗原可完全不用戊二醛，用4％多聚甲醛固定1～4h。 •用PBS漂洗3～5次，每次20 min。 •用0.1 mol/L甘氨酸漂洗细胞5min，灭活自由醛基。这一步骤对用戊二醛固定的细胞尤为重要，因为戊二醛含有两个醛基，在固定时其中的一个醛基可能与细胞成分结合，而留下一个自由的醛基，若这个自由的醛基不被阻断，则能与阻断液中的蛋白或抗体结合，从而增 加非特异性背景染色。 •用含1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞15min，以阻断对一抗的非特异性结合。阻断液可以是2％～10％BSA，也可以是卵蛋白（OVA）、正常血清或IgG片段。 •室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2h，用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5min，以除去未结合的一抗。如果非特异性染色背景很高，可在漂洗液中加入0.1mol/L EDTA。 •室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、蛋白A-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育细胞30min。 •用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5 min。 •室温下用2％戊二醛+2％多聚甲醛（用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.4）再次固定细胞1 h。 •用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1％锇酸后固定，常规脱水包埋，超薄切片铀铅染色后透射电镜下观察。也可按常规扫描样品制备方法处理，在扫描电镜下观察细胞表面的胶体金标记情况，由于扫描电镜分辨率的限制，应选用40nm以上的胶体金或采用银加强染色法。 •对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
细胞表面抗原标记（直接法）
•按间接法前4步操作。 •室温下用适当稀释的第一抗体-胶体金复合物孵育细胞lh。 •按间接法步骤7～10操作。
纳金（超微金）-银加强法标记细胞内抗原（0chs等，1994年）
•将单个盖玻片放人直径为35mm的皮氏培养皿中，加入3ml培养液。 •培养2～3d后，用PBS洗单层细胞，然后用3％的甲醛（由对甲醛新配制而成）室温下固定30min，用PBS（pH7.4）缓冲液改变戊二醛的含量（0.01％～0.5％）。 •用来检验每种抗原的戊二醛浓度并不相同，但戊二醛浓度越高，固定效果越好。应有一份不加戊二醛的样本作为阳性对照，因为大多数抗原都能被戊二醛固定。固定时溶液的pH值应与细胞生长时的pH值一样。 •用PBS洗细胞三次，每次10min，用35mmol／L的甘氨酸或1mg／ml的NaBH4/PBS液猝灭三次，每次5min。 •室温下用0.2％的TritonX-100/PBS液渗透细胞5min。 •用PBS洗细胞3次，每次5min。 •室温下用1％的正常羊血清(NGS)/PBS液（NGS/PBS）封闭细胞30min。 •用在1％NGS/PBS稀释下的一抗孵育细胞，室温下1h或4℃过夜。 •PBS洗细胞3次，每次5min。 •用1％的NGS/PBS封闭细胞30min。 •用与抗人、抗鼠或抗兔Fab共价相连的1.4nm超微金颗粒在1％，NGS/PBS中稀释成1/100，室温下摇动培育细胞1h。 •PBS洗细胞3次，每次5min。 •用l％的戊二醛/PBS固定细胞30min。 •用PBS洗3次，每次5min。 •用双蒸水洗3次，每次5min。 •室温下避光用HQ银[根据厂商说明（Nanophobes）]进行银增强， 3～4min，时间越长，银包被的金颗粒就越大。 •水洗3次，每次5min，终止银反应。 •用1％的OsO4的二甲胂酸盐缓冲液，pH7.3，固定样本30min。 •用水洗样本3次，每次5min。 •用乙醇脱水，Epon 812包埋。 •检查由柠檬酸铅和醋酸铀染色的或未染色的薄切片。 •金颗粒标记可以通过EM底片进行定量分析，分析结果可表示为“金颗粒数/μm2”。
- 包埋后胶体金标记免疫电镜
包埋后免疫胶体金标记是应用最广泛的免疫电镜技术，标本经固定、包埋、切片后在超薄切片上进行免疫标记。包埋后免疫胶体金标记也可分为直接法和间接法两种：
直接法是用与胶体金交联的第一抗体直接进行标记；间接法是用不带标记物的第一抗体先与组织反应，然后用胶体金标记的第二抗体或第三抗体、蛋白A或蛋白G等特异性结合第一抗体，因此只要制备一种胶体金探针就能用于许多抗原的标记，方法更为简便，且敏感性比直接法高。蛋白A和蛋白G的胶体金探针是包埋后免疫胶体金标记中应用最广的第二试剂，它们对不同种抗体的亲和力，可根据一抗的种类选择合适的胶体金探针。抗体-胶体金探针也较常用，但其稳定性不如蛋白A-胶体金探针。此外，胶体金标记的亲和素（avidin）、凝集素（1ectins）以及酶也曾被应用于包埋后标记。
标准方法
•标本用固定液在室温或4℃下固定1～6 h。 •标本用PBS漂洗3次，每次10 min。 •用0.1 mol/L甘氨酸漂洗标本20～30min，封闭残留的自由醛基。 •用PBS漂洗标本3次，每次10 min。 •低温脱水：4℃，30％乙醇脱水10min；4℃，50％乙醇脱水30min；-20℃，70％乙醇脱水1h；-35℃，90％乙醇脱水1h；-35℃，100％乙醇脱水1h。 •低温渗透：-35℃，以1：1和1：2的无水乙醇：低温包埋剂（LRWhite，LR Gold，Lowicryl）各渗透1h；纯低温包埋剂渗透1h；纯低温包埋剂渗透过夜。 •包埋、聚合：明胶胶囊作包埋模具，紫外灯聚合箱内，用365nm紫外灯进行光聚合，在-35℃下聚合1～2天，转入室温再聚合2～3天。 •超薄切片：切片的厚度较一般的略为厚一点（切片的光干涉色呈淡金黄色），将切片捞在镍网上。 •蚀刻（此步可省略）：用于蚀刻的溶液有三种：饱和过碘酸钠水溶液、1％ H2O2、乙醇盐，目的是暴露切片内部的抗原、使试剂能穿透标本，但此步处理常会使超微结构受到破坏，且会影响抗原性。若非必要，一般不作蚀刻。蚀刻的作法是，在parafilm或蜡片上滴一滴用于蚀刻的液体，然后将带有切片的镍网轻轻漂浮在液滴上（有切片的一面向下）。蚀刻后直至免疫标记完成，镍网应始终保持湿润状态，否则易出现难以清洗的非特异性反应。 •用去离子双蒸水漂洗切片3～5次。 •切片用1％BSA或5％正常血清（无钙镁Dulbecco's PBS或TBS配制）孵育15～30min以阻断对第一抗体的非特异性结合。Brorson SH建议用5％BSA孵育1h以去除非特异性标记，BSA的浓度过高或孵育时间过长可能会使标记率下降。 •用适当稀释的第一抗体室温孵育l～2h。一抗用含0.1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS或TBS稀释。 •用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS漂洗切片6次。 •室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、SPA-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育30～60min。 •漂洗同上步骤。 •用去离子双蒸水冲洗切片。 •用醋酸铀和硝酸铅染色后在透射电镜下观察。 •对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
链霉亲和素-胶体金法
生物素-亲和素（biotin-avidin）检测系统已被广泛应用于免疫细胞化学和分子生物学。该系统利用生物素与亲和素之间的高度亲和力（解离常数：10-15）而建立的。亲和素会与许多组织非特异性结合，这主要是由于它是一种糖基化的蛋白，而且具有很高的等电点（pI=10）。由于亲和素的非特异性结合问题，目前亲和素已基本被链霉亲和素(streptavidin)所代替。链霉亲和素具有同亲和素类似的特性，但没有糖基化，几乎没有非特异性结合。链霉亲和素-胶体金检测系统常在包埋后免疫细胞化学中应用，这个系统常常由不作标记的一抗、生物素化的二抗和链霉亲和素-胶体金组成，也可不用二抗，直接使用生物素化的一抗和链霉亲和素-胶体金。该系统所需的试剂都已商品化，可以从试剂公司购买得到。 •按以上标准方法中的前12步操作。 •室温下，用适当稀释的二抗-生物素孵育切片30min。 •用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。 •室温下用适当稀释的链霉亲和素-胶体金探针孵育30min。 •用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。 •醋酸铀、枸缘酸铅染色后在透射电镜下观察结果。 •对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
双重或多重免疫标记法
由于在制备过程中胶体金颗粒的直径可以控制，因此就可以利用不同大小的胶体金颗粒做双重免疫标记甚至三重免疫标记。做双重免疫标记时，一般选择5nm和15nm胶体金，在透射电镜下很容易区分这两种胶体金。做三重免疫标记时，则选择5nm、10 nm和15nm胶体金。应使用经蔗糖梯度离心纯化得到的大小均一的胶体金探针。双重或多重免疫标记有多种方法，如直接法、间接法、双面双重标记法等。间接法必须在第一种抗原被标记完成后用甲醛蒸气阻断可能存在的游离的第一抗体结合位点，阻断的时间必须控制好，时间太短则会造成交叉免疫反应，太长则会影响后一种抗原的标记率。双面双重标记法在操作时必须非常小心，不能弄混标记面，且不能将抗体沾到另一面，否则会影响结果的准确性。鉴于以上原因，推荐采用直接法进行双重 标记，标记效果好，对阳性结果容易做出正确的判断和分析。直接法是将针对两种或三种抗原的抗体分别与不同直径的胶体金结合，然后直接进行免疫标记。免疫标记时先将切片与一种抗体-胶体金孵育，用TBS漂洗后再与另一种抗体-胶体金孵育，其他步骤同包埋后免疫胶体金单标记法。
酶标记免疫电镜
- 组织抗原的包埋前免疫酶标记
•固定：免疫电镜通常采用4％多聚甲醛和低浓度的戊二醛（0.1％～0.5％）混合液灌注固定。PBS充分洗涤。 •预切片：用振动切片机将样品切成40～60μm的厚片。 •正常山羊血清（1：20）室温30 min。 •加入适当稀释的第一抗体，置冰箱（4℃）内24h。PBS充分洗涤。 •正常山羊血清（1：20）室温30 min。 •加入稀释好的HRP标记的第二抗体。室温1h。PBS充分洗涤。 •2.5％戊二醛后固定15～30min。PBS充分洗涤。 •0.75mg/ml的DAB溶液，室温避光反应15min。 •加等量DAB溶液，内含0.02％H2O2（加入后最终浓度为0.01％），室温避光反应15～20min。PBS充分洗涤。 •在解剖显微镜下观察免疫反应阳性部位并取下。 •用1％锇酸（pH 7.4）后固定0.5～1h。PBS充分洗涤。 •梯度乙醇或丙酮脱水。 •环氧树脂包埋。 •超薄切片，铀、铅染色或单染或不染。 •电镜观察。
- 组织抗原的包埋后免疫酶标记
•新鲜组织经固定后（勿用OsO4后固定），低温下进行梯度乙醇脱水，用低温包埋剂进行包埋、光聚合，超薄切片（用镍网捞片）。 •正常山羊血清（1：20，用pH 7.6的0.02mol/L TBS稀释）室温孵育5～15 min。 •加入适当稀释的第一抗体（兔抗血清）（用含1％正常山羊血清的0.02mol/LTBS）4℃孵育过夜，然后用TBS漂洗。 •山羊抗免IgG（稀释液同一抗）室温30～60min，然后用TBS洗涤。 •兔PAP复合物（稀释液同一抗）室温30min后用TBS洗涤。 •DAB－4HCl/$H_2O$（0.0125％/0.0025％）室温15min后用TBS洗。 •1％ OsO4固定10～15min。水洗后用醋酸铀单染或不染。 •电镜观察。
对照实验： •吸收实验：将足量的抗原如P物质加入抗P物质的抗血清内，离心取其上清液，用这样的血清代替一抗，结果应为阴性。 •替换试验：用正常血清为第一抗体，结果为阴性。
- 冷冻超薄切片免疫电镜
在包埋前免疫标记中要用化学的或物理的方法增加膜的通透性，在包埋后免疫标记条件下，又需经化学剂脱水、包埋剂渗透聚合后再进行免疫标记，这样处理都可能对蛋白质的抗原性带来危害。采用免疫冷冻超薄切片技术可以避免这些缺点，显示上述方法所不能显示的抗原。冷冻超薄切片是用冰冻的、经过固定但未经包埋的组织切成的，在免疫标记后再将切片加以包埋，以防止切片干燥收缩引起的结构改变。该方法进行的顺序是固定、蔗糖浸泡、切片、切片收集、免疫标记和重金属染色。
在切冷冻超薄切片之前，最好先用冷冻半薄切片做免疫荧光标记以确定阳性部位。由于戊二醛能发射荧光，故凡经戊二醛固定的标本，在免疫标记前需用NaBH4阻断此作用。
冷冻超薄切片免疫标记的主要步骤。为叙述方便，抗原、抗体、蛋白质A和金颗粒分别用AG、AB、PA和g来表示。
单标记
最先进行的"阻断"或"检验"步骤是为了减弱非特异标记。一般来说，在冷冻切片中降低非特异性标记比塑料切片中容易。各种不同的蛋白质如牛血清白蛋白或明胶，已经成功地用于这个目的。最近，l％～5％的小牛或山羊血清或鱼皮明胶也被广泛应用。这里描述的免疫标记步骤使用的试剂是0.5％BSA。通常，所有的免疫标记和重金属染色步骤均在石蜡封口膜（Parafilm）上进行。
•将载网浮在0.5～l ml含0.0lmol/L甘氨酸和0.5％BSA的PBS溶液（简称PBS-BSA）中5～10min。 •将5～10μl含有第一抗体的PBS-BSA溶液滴放在Parafilm上，用抗表面张力镊子把每个载网从PBS-BSA溶液移到抗体溶液上，孵育10～30min。 •用镊子将每个载网夹到少量的PBS液滴上清洗至少1min。放置3个较大的液滴，用金属丝环将载网移至较大的液滴上，每隔3min或更长时间将载网移入其中。如果研究的对象是膜结构，则用PBS-BSA来代替PBS。 •重复以上3步骤，用第二抗体或附着3～20nm金颗粒的蛋白质A进行第二步免疫标记。 •用1％的GA将载网上的切片固定10min，以加强结构的完整性和抗体或蛋白质A与切片的交联。 •将网在水中清洗4次，每次2min，用于染色包埋。
平行双标记
从本质上说，它是平行地进行两个单标记，同时标记两个抗原。将由两种不同动物对两个抗原产生的两个抗体混合（如兔抗X抗体和豚鼠抗Y抗体）。按前面所述对该混合液进行第一步标记。交叉吸收两种动物IgG的抗体。将这些有标记的抗体混合，然后平行地对这两个第一抗体进行第二步标记。
GA阻断的系列多重标记
尽管上面描述的系列双标记在很多情况下进行得很好，但由于在一些情况下，蛋白质A与IgG的Fc和Fab区都发生反应，以及胶体金标记的蛋白质A与抗体的解离，会显示错误标记。Slot等（1991）利用抗体即IgG对GA敏感而某些抗原不敏感这一优点克服了这个困难。在完成第一个单标记后，用GA固定切片；这样AB1和PA都不再与下一阶段的AB2或PA发生反应。重复此流程，即AB→PA：g→GA固定→淬灭残余的GA，这样就能成功地进行非常好的三重标记。
在这个流程中，对GA敏感的和不敏感的抗原进行标记时，对GA敏感的抗原首先标记。应该仔细分析信噪比。现在系列双标记和系列多重标记是唯一对来源于同一种动物的抗体进行双标记的可行的方法。如果抗原对GA敏感但对FA不敏感，可以用FA代替GA。
电镜原位杂交
电镜原位核酸杂交技术的原理和操作步骤与光镜原位杂交技术基本一致。杂交反应可在组织包埋前或包埋后进行，也可用在冷冻超薄切片上进行。
电镜原位杂交的准备
100×Denhardt溶液的配制：聚乙烯吡咯酮（PVP）10g，牛血清清蛋白（BSA）10g，聚蔗糖400（Ficol 400）10g，加H2O至500ml，过滤除菌，-20℃保存。
DEPC（二乙基焦碳酸酯）溶液的配制：取DEPC 1m1加入1,000m1双蒸水中，经振摇后，室温静置数小时，然后高压灭菌。
放标本的实验容器可用DEPC处理或高温180℃干烤2h。DEPC可灭活各种蛋白质，是RNA酶的抑制剂。
- 包埋前原位杂交
将已完成杂交操作的标本，按照常规电镜制样方法进行包埋、超薄切片、染色、电镜观察。其操作流程为：样品→固定（多聚甲醛-戊二醛混合液）→振动切片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→锇酸固定→脱水→包埋→超薄切片→铀铅染色→电镜观察。
- 包埋后原位杂交
按照包埋后免疫标记电镜技术的制样方法，取材、固定、包埋、超薄切片，然后再进行原位杂交，其操作流程为：样品→多聚甲醛（或多聚甲醛-戊二醛）固定→低温脱水→低温包埋→超薄切片→镍网捞片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→铀铅染色→电镜观察。
- 不包埋原位杂交
就是将细胞悬液、染色体和冷冻切片等样品，不进行包埋、涂片或切片即直接进行原位杂交。其操作流程为：活细胞悬液、染色体、冷冻切片→固定→原位杂交→胶体金标记→电镜观察。