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单颗粒三维重构基本原理

单颗粒三维重构主要基于“中央截面定理”，但是由于生物样品自身的一些特点，单颗粒技术还需要用到 信号处理的其它方法。首先，生物大分子颗粒取向在溶液中是随机，因此首先要做的，就是在电镜照片中， 估计每一个颗粒的取向，单颗粒技术中主要用到“等价线方法”；其次，由于含水的生物样品对电子散射能力很弱， 加上低剂量成像，因此电镜照片的信噪比极低，如何从信噪比极低的图像中提取有用的信息，需要用到 一些去噪或滤波方法，单颗粒技术中主要用到的是“相干平均”方法；再次，由于单颗粒的电镜照片是在欠焦的条件下得到的， 因此图像信号受“衬度传递函数”的调制，因此需要对图像进行解调处理之后才能得到正确的重构结果； 第四，对三维重构结果的评价标准就是重构的有效分辨率，对重构结果进行分辨率估计有也多种方法。

限制单颗粒技术重构分辨率的主要因素有两个，一个是样品的全同性，一个是电镜照片的质量。 具有二十面体对称性的病毒颗粒是一种理想的单颗粒研究对象，二十面体病毒衣壳具有较高的结构刚性， 易提纯，颗粒径长一般大于20nm，形态单一，易获得高质量的电镜照片。此外，二十面体病毒的高度对称性 相比于完全没有对称性可言的核糖体来说，只需要较少的颗粒数就可以达到较高的分辨率，对于二十面体对称 的病毒而言，重构到1nm以下，平均需要5000个颗粒%\cite{Bottcher1997} ，而对于p97 ATP酶， 7000个颗粒也只能到$24\AA$ %\cite{Rouiller2001} ，再如核糖体， 重构到$11.5\AA$用了7万个颗粒%\cite{Gabashvili2000} 。 尽管单颗粒技术目前还没有得到原子分辨率的重构结果，但是它在结构生物学研究中得到了非常广泛的应用。 一方面,其在方法学上的独特优势为它揭示生物学规律提供了很多重要信息。单颗粒技术可 以解析生物大分子在不同功能状态时的结构,比如结合不同的底物后研究结构有何变化,这对于揭示 蛋白或复合体发挥功能过程中的结构变化和作用机理都有着重要作用；另一方面，它可以有机的和X射线晶体 衍射技术得到的蛋白单体的原子结构拟合到中等分辨率的单颗粒三维重构结果中去，从而研究蛋白单体在 生理环境中的可能构象状态，目前，这种研究方式已经成为了一种大的趋势。

中央截面定理

中央截面定理的说明，任何三维物体的二维投影的傅立叶变换与原物体的三维傅立叶变换的三维图像的 过原点与投影方向垂直的截面（中心截面）等价。推导如下：

假设物体的质量密度为$\rho(\vec{r})$，显然，这定义三维实空间内，那么它在三维傅立叶空间的等价

变换为%\cite{DeRosier1968}
：
无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert):      F(\vec{k})=\int \rho(\vec{r})e^{2\pi i (\vec{k}\cdot     \vec{r})}d\vec{r}    

 在三维实空间沿着电子束方向投影，并规定该方向为矢量$\rho(\vec{r})$的$r_z$分量，则有：

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): p(r_x,r_y)=\int \rho(\vec{r})d r_z

  在三维傅立叶空间沿着投影方向，并定义该方向为矢量$\rho(\vec{k})$的$k_z$分量，则有：

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): F_{k_z=0}(k_x,K_y)=\int p(r_x,r_y)e^{2\pi i (k_x\cdot r_x+k_x\cdot r_y)}dr_x dr_y

这就意味着：在三维傅立叶空间，沿电子束方向截取$F(\vec
{k})$的截面，这个截面等于在实空间，$\rho(\vec{r})$在电子束方向投影的傅立叶变换。

冷冻电镜单颗粒技术可以让我们研究生物大分子在活性状态下的三维结构，冷冻电镜图 像是含水冷冻样品中随机取向的全同生物样品颗粒在电子束方向上的二维投影， 通过中央截面定理%\cite{Crowther-RA1970:3Drec}\cite{Klug1979} ， 多个二维投影的傅立叶变换按照其正确的空间投影取向和中心在三 维傅立叶空间叠加，通过三维反傅立叶变换，就可以得到全同颗粒在三维空间的像。其原理图 见图\ref{fig:chap03:CP}%\cite{Wah-Chiu1993}

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[width=0.7\textwidth]{spCP} \caption[中央截面原理示意图]{三维重构的中央截面定理原理示意图。（引自Wah Chiu讲义%\cite{Wah-Chiu1993} ） \label{fig:chap03:CP}} \end{figure}

%Graphical illusuation of the Central Projection Theorem for %three-dimensional reconstruction in electron imaging. This Theorem %states that the Fourier transform of a twodimensional projection %image of an object Ii(xi, yi) is equivalent to a section of the %threedimensional transform of that object F(Sx,Sy, Sz) cutting %through the center of the transform (Crowther et al., 1970).

二十面体的取向定义

二十面体是由20个等边三角形所组成的正多面体。每个二十面体共有12个顶点、20个面、30条边， 因为中心对称，所以有6个五次对称轴，10个三次对称轴，15个二次对称轴。 在空间中，二十面体的取向可以由欧拉角$(\phi,\theta,\omega)$ 和中心坐标$(x,y)$所定义。取向为（0，0，0）的二十面体在

   直角坐标系的位置如下图\ref{spRecOrientation}所示，x, y和z轴都通过二十面体的二次对称轴。中心坐标(x , y)即病
   毒颗粒的中心，欧拉角$(\phi,\theta,\omega)$ 定义为：首先围绕原始的z轴旋转，旋转角为$\phi$ ；然后围绕新的y轴旋转，旋
   转角为$\theta$ ；最后是围绕新的z轴旋转，旋转角为$\omega$ 。由此，任何一个二十面体的位置及取向都可以通过
   该参考坐标系描述。原图x轴上方的红色三角形区域就是其中一个非对称单元，二十面体共有60个
   （20×3）这样的可重复的最小结构单元，由于二十面的高度对称性，二十面体的取向范围可以局限
   于该三角形内。按照上述坐标系，$(31.717,90,\omega)$ 和$(-31.717,90,\omega)$ 正好对应于两个5次对称轴

（即位于二十面体顶点上），从该投影方向看，具有五重旋转轴对称性；$(0,69.09,\omega)$ 对应3次对称轴（即位于二十面体面的中心）， 具有三重旋转轴对称性；$0,90,\omega$ 对应2次对称轴（即位于二十面体边的中点处），具有二重旋转轴对称性。

%spRecOrientation Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[width=0.7\textwidth]{spRecOrientation} \caption[二十面体取向定义]{二十面体取向定义。\label{spRecOrientation}} \end{figure}

颗粒取向和中心的估计

对单颗粒三维重构而言，颗粒取向和中心的估计是三维重构中最关键的步骤。颗粒初始取向估 计采用自身等价线（Self-common Line,SCL）相位残差评价方法，然后用交互等价线 (Cross-common Line,CCL)相位残差评价方法确定颗粒的相对 取向%\cite{Fuller1996}\cite{Baker1999}\cite{Thuman-Commike2000} 。 选择相对取向稳定的3到5个颗粒作为三维重构的初始模板，以此模板为基础，用交互 等价线相位残差方法对其他的颗粒取向进行评价，选择取向手性一致，且相位残差较小的颗 粒进行较低分辨率的三维重构，然后以此重构结果在傅立叶空间的5个取向均匀的投影作为精 修模板，对初始取向估计较好的颗粒进行取向和中心的精修，通过循环精修的方法提高颗粒 取向和中心估计的质量，从而使三维重构的分辨率得到提高。三维重构的流程图见图 \ref{fig:chap03:3DrecDiagram} %spRecDiagram

Image:.jpg[htbp]

\centering \includegraphics[width=\textwidth]{spRecDiagram} \caption[三维重构流程图]{三维重构流程图，引自(程凌鹏，2004) \label{fig:chap03:3DrecDiagram}} \end{figure}

颗粒取向估计的质量以及以此 为基础得到的模板的质量决定了整个重构工作的质量和准确性%\cite{Thuman-Commike2000} 。 颗粒初始取向估计的好坏受很多因素的影响，其中最主要的两个因素，一个是冷冻电镜图像 本身的信噪比，一个是颗粒自身的结构特征。虽然在冷冻条件下，样品对电子辐射损伤的耐 受能力大大增强，但是在实际成像时仍然要谨慎的选择电子剂量。有研究表明：在-170摄氏 度下，对直径30nm以下的病毒颗粒，要达到1nm左右的分辨率，电子辐射剂量不应大于16个电 子每平方埃%\cite{Conway1993} 。在如此低的电子剂量下，图像的信噪比是非常低的。信噪比越低，通过自身 等价线相位残差评价方法估计颗粒取向的误差也就越大。除信噪比外，颗粒自身的结构特征 对取向估计也有着重要的影响，由于病毒衣壳具有较高的二十面体对称性和结构刚性，因此病 毒衣壳的结构特征在颗粒取向的估计中起着主要的作用。颗粒表面越光滑，取向估计的准确性 和稳定性也越差。之所以在取向估计的时候要进行滤波，除了提高信噪比的原因外， 也是基于结构自洽的原因：低频结构的取向和中心对齐之后，高频结构当然也是一致对齐的。 但是，低频结构对较小的偏差（取向和中心）并不敏感，因而，需要通过不断迭代精修的方法， 逐级增加低通滤波的截止频率，并增加相干叠加的颗粒数目，逐渐改善高频结构的信噪比， 使之足以对中心和取向的偏差进行校正。

自身等价线

由于二十面体的对称性，二十面体病毒颗粒的取向，总可以定义在一个非对称单元内， 同一颗粒在空间中的任一可能取向，可以通过5-3-2次轴的对称操作得到。 非对称单元中某一取向的傅立叶中心截面A，与绕任一对称轴做正 负两个方向的对称操作后得到的中心截面B、C之间可以在截面A上产生两条交线，这两条交线 在数值分布上是完全等价的，这两条交线的夹角，与该中心截面在非对称单元中的取向是一一 对应的，这样的两条交线就构成了一对自身等价线，见图\ref{spSCL}。 不同的对称操作会产生不同的等价线，一共有37对，当取向恰好落在对称轴上 时，自身等价线的数目会因取向简并(degenrate)而减少，见图\ref{spCLdegenrate}。 通过搜索某一中心截面上的等价线分布，就可以 确定该中心截面在非对称单元中的取向。通过计算非对称单元中所有取向各自对应的等价线之 间的残差，相位残差之和最小的一组等价线所对应的取向就是该颗粒的可能取向。在傅立叶空 间，等价线上对应点的残差可以是振幅残差或者相位残差，由于傅立叶变换的振幅平 移不变性，因此在取向和中心的精修过程中，只计算对位置信息敏感的等价线相位残差。在 Crowther提出了经典的自身等价线相位残差算法后，有人根据颗粒取向的统计特性发展了 分布加权算法和t分布加权算法。在IMIRS单颗粒三维重构软件中，同时使用了这三种算法%\cite{Liang2002} 。

交互等价线

以其中一个二十面体的中央截面作为参考，另外一个二十面体的中央截面进行对称操作得到59个对称面， 这些面（60个）与参考面共产生60对交互等价线,见图\ref{spCCL}。一对等价线中各对应点的差值称为残差，残差大小由投影 的中心和取向所决定，如果投影中心和方向估计准确，则残差较小；反之较大。因此，可以以二十面体一 个非对称单元上的取向作为估计取向的集合，以一定角度作为间隔，分别计算这些投影取向上的残差加权和 （由于接近对称轴的投影取向时会出现等价线的退化现象，所以会采用T分布或 分布），以残差最小的取 向估计作为投影的取向。交互等价线用于估计截面和参考面之间的取向。

三维重构的基本步骤

冷冻电镜照片的数字化

生物样品成像信息记录在电镜胶片中。首先必须经过高分辨率光密度仪把胶片中的样品的光密度 数字化成能用计算机处理的数字信号。数字化时要注意保护胶片不被染上指纹、不被刮伤、尽量 不要染上灰尘等。在数字化前用肉眼观察，避免使用有像散、样品漂移和颗粒数很少的胶片。在 数字化胶片时，胶片的方向不要放反，所有胶片的像的记录的面要一致。在数字化时尽可能避开有 大片冰污染的部分。 在数字化时值得注意的是采样间距（步长）的选取。Shannon采样定理指出，如果一个模拟信号以R/2的 间距距采样，那么这个信号可以恢复的最大分辨率为R。但是还要考虑到重构中最大分辨率数据部分的 混叠效应。通常如果目标分辨率为R，数字化时的采样点距取R/4左右。在实际数字化操作时还要考虑到 电镜的放大倍数。设电镜放大倍数为mag，数字化仪的数字化步长应该取mag?R/4左右。例如，我们想获 得8 ?分辨率的重构，如果电镜的放大倍数是50,000×，那么上例中实际数字化间距应该是50000×4? /4＝50000 ?。 实际数字化间距还要考虑到所拍摄的电镜图像本身所能达到的分辨率。因为无论重构算法如何的好，重构出来的分 辨率一定不会高于拍摄的照片的分辨率。图像所能达到的分辨率可以通过大量生物样品颗粒图像叠加确定最大CTF 亮环的位置来计算得到。 有些电镜本身配有CCD摄像头，可以直接记录冷冻电镜拍摄到的数字图像。但是CCD记录的图像分辨率不高。这是 由于：1）如果用电镜胶片在常用的采样间距下（? /pixel）进行数字化， 所获得的像素也是现在最大尺度的CCD摄 像头（4k×4k像素）所能记录的像素的8倍以上。2）由于CCD摄像系统的点扩展函数（point spread function）影响， 所记录冷冻电镜图像的高分辨率信息被衰减，在电镜高加速电压下该影响更为严重。所以CCD不适合记录高分辨率冷冻 电镜图像的信息。最近有报道用CCD记录的冷冻电镜图像获得的最高重构分辨率是质多角体病毒的三维结构，达到9?。

图像质量评估和颗粒的选取

病毒图像的质量评估对后面的处理步骤至关重要。低质量的图像无法重构出正确的结果。除了上面所述的 凭人眼剔除明显有缺陷的病毒颗粒外，病毒图像质量还必须在傅立叶空间进一步评估。其具体方法是：对 框取出来的每一个单颗粒图像进行傅立叶变换，然后把同一张图像中框取出来的颗粒的傅立叶变换系数振 幅做叠加，从叠加后的图像中可以看到有明暗相间的CTF环存在。如果叠加图像中看不到环，那就说明图像 质量较差，这样的图像通常无法重构。值得注意的是，如果欠焦值较小，也可能看不到环的存在。这就需要 更多的颗粒做平均才能看清楚CTF环。这是因为欠焦值较小的图像和欠焦值较大的相比其CTF暗环（即CTF调 制曲线的零点）处于较高的频率，而高频区域由于受到高斯曲线的调制而被严重衰减，所以需要更多的颗粒 叠加来增加图像的衬度。如果在一张图像中病毒颗粒数目不多，可以框取没有病毒颗粒的图像部分，然后将 其象病毒颗粒一样保存为文件，这样的小图像也可以用来傅立叶变换叠加以评估图像质量。这是因为CTF环 的存在是电镜本身的属性决定的。如果过量的电子辐射造成了样品的辐射损伤，这样的图像也可以看到清楚 的CTF环，但实际上图像的质量并非很好。如果CTF环呈椭圆形，说明电镜图像存在像散。存在明显像散 、样品漂移和辐射损伤的照片是不能用于单颗粒三维重构的。

颗粒的选取一般由人工挑选完成。框取时要避免选择有污染的颗粒、 避免选择不完整的颗粒、避免选取亮度不均匀，存在亮度梯度的颗粒。框取颗粒时选择正方形框的尺寸必须稍大于病毒 尺寸，尽可能使得病毒颗粒的中心和框的中心一致。框的像素尺寸的最大素数因子必须小于19，这是由快速傅立叶变换 算法决定的。

在一对欠焦对中，先框取大欠焦图像中的颗粒。因为每一对大、小欠焦图像取自相同的区域，不同的仅仅是欠焦值。因 为底片经过扫描后，一对大小欠焦对图像中的颗粒相对位置会产生稍稍的平移或旋转，所以完成框取大欠焦图像中的颗 粒后，这些框的位置需要通过软件自动匹配到小欠焦图像中，从而自动框取了小欠焦图像中的颗粒。

高分辨率重构要求数处理以千计、甚至更多的颗粒，这么大的工作量往往需要计算机自动识别技术来辅助完成。 但问题是要获得高分辨率的图像，冷冻电镜成像的欠焦值必须较小，这样的图像的衬度就小导致计算机自动 识别上的困难。在计算机自动识别选取颗粒后，经常还是要人工检查校对。如何从大张的冷冻电镜图像中 准确识别出生物大分子颗粒仍然是有待进一步研究的课题。

图像的滤波

冷冻电镜图像在经过CTF校正后，必须进行带通滤波处理。冷冻电镜图像中，极低频率的数据表示图像中的大尺 度的密度梯度信息，而不是样品颗粒的结构信息。这些低频信息严重影响后面用交互相关法对颗粒图像进行配准， 所以必须滤去。而较高频率的数据尽管包含了样品颗粒的高分辨率信息，但是同时也包含了噪声的信息。而在单颗 粒重构的初始步骤中，需要获得的是一个低分辨率的三维结构用来制作模板，所以高频数据也必须滤去。此后的迭 代步骤中需要再次引入高频数据以不断提高三维重构的分辨率。 在滤波处理后，所有的颗粒图像的背景部分被一个所给定半径的圆掩模以减少背景噪声。然后圆内的颗粒图像数据 被规格化，使得数据的平均值为零，并且具有随机的标准偏差。 滤波的方法有很多中，进一步讨论参见滤波一节。

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