1、为什么没有铀染液的配方？

铀染色的配方一般是醋酸铀的饱和溶液即可，可用50％乙醇配，但我们一般用蒸馏水配置。充分溶解后，过滤，但不管怎样过滤，过一段时间，都可析出铀的沉淀，所以，一般配置十来毫升后，放在桌面，不要摇动，用的时候，只用上清，千万不要抖动沉淀。我一般做法是配置约3％－4％，充分溶解后，用滤纸过虑，然后用一段时间。但时间太长会影响效果，所以，你可重新配置。

2、刘哲听他老板姚老师说，配铀染液还可以用离心管配制，然后每次用之前拿一小管去离心，取上清， 这样可以避免枪头吸到沉淀，你觉得这种做法如何？他只是提议。

可以按姚老师方法配置，但量少时，你很难控制醋酸铀。你可试试，我也曾经这样做过，但因为这样，每次只能配少量，没用多久，就要重新配，所以，后来配了大瓶子的。用离心管的话，每次离心前离心的目的也是为了不把沉淀吸进去用。

3、制刀的时间到底应该提前多久？粘水槽呢？

制刀时间多久不需要准确。一般用的时候才制刀，目的是，制备好的刀放在空气中，有时有灰尘或别的，到时，刀刃就会蔬水，切下来的片就会老粘在刀刃上，而不是浮在水面上。所以，一般切片前才制。制完了粘水槽。如果熟练了，我一般一到先制刀，粘水槽，然后修块，修好块，刀槽也干了，就可以对刀，切片了。

4、样品修块的时候，要不要整个切面都是样品的？还是可以有一部分是包埋剂的？

最好是全部是样品，但有时样品的形状不一定那么平整，但起码大部分是样品，少量是包埋剂。刚学的时候，样品块可以修小一点。不要怕修掉一点样品。但有些人如果有特殊的要求，一定要在哪个位置，一般植物很多有这样的要求，就得小心，如你现在没这样的经验，就不要答应他们做这样的工作。

5、废弃的锇酸，铀染液和铅染液该怎么处置呢？

正常应该放在一个地方回收，现在都直接倒在水池了。我也觉得不大好，我看你准备一个费瓶，把所有这些东西都倒在一个瓶子，以后再看做什么处理。

• 溶液配方

3％的戊二醛30ml： 用50％的戊二醛原液1.8ml，用0.1M PBS 28.2ml混匀。

PBS（磷酸缓冲液配制方法，水用蒸馏水）（这个配方我记不准了，我写在一张硬纸上的，你可让戴兴红或李志红跟你算一下，对不对）

溶液一：磷酸氢二钠（0.2M）溶液配制——称量 磷酸氢二钠 Na2HPQ4-2H2O 35.61g 或 Na2HPQ4-7H2O 53.65g 或 Na2HPQ4-12H2O 71.64g 溶于水至1000ml。

溶液二：磷酸二氢钠（0.2M）溶液配制——称量 磷酸二氢钠 NaH2PQ4-H2O 27.6g 或 NaH2PQ4-2H2O 31.21g 或 NaH2PQ4 24g 溶于水至1000ml。 配0.2M PBS——取溶液一 36ml+溶液二 14ml

0.1M PB的配制方法： 100ml 的0.2M PB= 36ml NaHPO4（这是指上面配置的溶液） + 14Na2HPQ4（这是指上面配置的溶液） + 50ml 蒸馏水（具体配方我记不住了，看一下张老师编的书）

铅染配方：

10ml容量瓶：10ml去CO2双蒸水（温水，也就是刚刚煮好的蒸馏水或双蒸水）+ 0.2g 柠檬酸铅 + 数滴去CO2 10N NaOH 用力摇，直至消除大块的沉淀，立即变清。

5ml容量瓶：0.01g 柠檬酸铅 + 5ml去CO2双蒸水（温水）用力摇至几乎无沉淀，而呈乳白色 + 一数滴去CO2 10N NaOH 立即变清，但有细小沉淀。（可能你需要写一封邮件问一下小黄，我走时让她摸好条件，给陈东留着的。柠檬酸铅大概是前年买的新的进口的，老的不能用，不知你知不知道放在哪，我现在无法知道这些东西放在哪了，如果不知道，就得跟陈东联系一下）

• 固定

样品用2.5％（你配置3％就用3％）的戊二醇固定 （戊二醇的体积约是样品体积20倍，大张老师说是40倍），固定时使样品剥离管壁，但不要弄碎样品，可放置过夜。（有时实在没办法，放置一个星期也可以，但尽量过夜就做下去，但植物样品和酵母等有细胞壁的，就得时间延长，浓度也最好用高一点的，如5％）

• 制样的准备工作

洗吸管和烧杯，正常来说应该是每次做完实验时完成的。

先用水冲洗——如果还看到有污迹，就用洗衣粉洗；如果有包埋剂，用回收的废旧丙酮清洗，如果洗完还有一点粘乎乎的感觉，再用洗衣粉清洗——然后用蒸馏水溜一遍——最后放进烘箱烘干待用。至少需要半天时间才能烘干。经常保持在烘干箱中5－10支干净的吸管，潮湿和脏的东西对包埋和渗透非常不利。

• 配包埋剂

（小张老师）包埋剂（Epon）是当天配。我们常用的另一种包埋剂spurr当天配肯定不行，非常脆的。 配好的包埋剂打开用一次后，一般就倒掉不要再用了。所以最好根据预约的样品个数，配好下周的用量，每周配下周用的。一般10个样品以内的，按下面配方的一半的量，10个样品以上，20样品以下的，按下面配方的量，如果再多，就再增加。一开始不熟，可多配些，但用一次，就不能再用了。

   spurr配方如下：
   component    product   weight in grams
   NSA          N7644     12
   VCD          V3630     5
   DER 736      D8165     4
   DMAE         D4256     0.2

按上面的顺序从多到少的用天平称量药品，而且质量要非常精确。（每次用完后，记得把磁力搅拌器的转子也洗干净，烘干，一般应该起码有两个小转子专门用于配包埋剂，不要让别人使用，配置好后，转子可以放在配好的包埋剂中，等用完了，跟杯子一起洗）最后的催化剂（量最少的那一种）是要在其它的溶液混合搅拌4小时以上后再加的，然后再充分搅拌4小时左右后放进4度冰箱，放置3－4天就可使用。有时放置时间过短会导致很脆，所以我的经验是放置4－7天，比较安全。如果配好后，用封口膜封好，放置在冰箱不打开的话，可以放置很久的。

• 制样

（陈老师）动物样品和植物、酵母样品的制样有所不同，植物和酵母使用的药品浓度和时间要翻倍，特别是锇酸最好过夜。（刘哲）由于酵母难于聚合成团，因此可在每个步骤后面进行一次离心，速度为6500转一分钟（这样对样品不好，可以在戊二醛固定2小时后，离心成团，然后有两种方法进行预包埋，一种是离心成团的时候，准备好加热溶解的琼脂（琼脂配方和药品都可跟跑核酸的胶一样，可问问研究生），等琼脂凉到快凝固时，把刚才离心成团的样品的上清吸干，倒入快凝固的琼脂，轻轻用牙签挑起管底的样品，使样品悬浮在琼脂中，等琼脂凝固，这时样品应该成团包埋在琼脂中，然后取出这琼脂块，切掉样品周围的多余的琼脂，但一定要留着写琼脂，保证它把样品包住不散。这个方法的难点是，琼脂凝固的温度太高时，容易损伤样品，所以使用时非常小心。还有一种方法是，先让样品在戊二醛中固定1－2小时后，离心成团，然后倒入生鸡蛋的蛋清，再轻轻挑动样品，使它脱离管壁，让样品悬浮在蛋清中，然后重新加入戊二醛再固定1－2小时以上，这时，蛋清变性，应该使样品成团一点，但也会有一些散开，只要保持几小块就可以了。这个方法中，蛋清的量要把握好，太多了，会影响固定的效果，太少了，会导致样品还是没有成团。下面制样步骤以动物样品为例：

第一天早上8点开始，样品应该已经在前一夜处于戊二醛中，从冰箱中拿出包埋剂，在室温中等温度升到室温。因为温度低时，包埋剂会很粘，所以从冰箱中取出后，应在磁力搅拌器中搅拌，注意不要太快，因为会越搅越快的。临用前，注意搅拌速度不要太快，防止内部出现太多气泡，这些气泡会带到最后的包埋中。

吸出固定样品用的戊二醛，用0.1M PB缓冲液（PH=7.2）冲洗三次，每5-10min换一次，陈老师建议7分钟。每次换液，加入溶液后，轻轻弹一下管，或者就将离心管上下轻轻倒一下就能达到脱离管壁的目的，对于易碎的样品，非常小的样品可不要太多动它。都注意要使得样品剥离管壁，可以用手指弹管壁，或者用吸管吹动缓冲液两种方法，但不要弄碎样品，以后均是。

（小张老师）1％（我在临走前都用1.5%-2%）锇酸固定60min－90min，注意观察样品变黑的快慢，锇酸固定太久也不好。样品体积也不能太小，也不能太大，否则锇酸不易渗透进去。如果样品太大，应用牙签把样品挑出来，用刀片割小一点。

锇酸有毒，有挥发性，易伤粘膜，应在通风厨内带手套操作。锇酸废液应及时加入乙醇，使锇酸沉淀后尽快扔掉。这个过程和下面的过程最好用枪头吸取。

吸出锇酸，用0.1M PB缓冲液（PH=7.2）冲洗三次，注意吸干净管盖的液体，每5-10min换一次，陈老师建议7分钟。此步清洗不干净，锇会与后面加入的乙醇发生反应，形成沉淀。

吸弃（此时已经不是锇酸了，而是磷酸缓冲液）液，加入30％乙醇逐步脱水，室温放置10min。加入溶液后小心翻转，让沉淀扬起，使溶液入侵样品，下面操作同。

    吸弃溶液，加入50％乙醇逐步脱水，室温放置10min
   吸弃溶液，加入70％乙醇逐步脱水，室温放置10min
   吸弃溶液，加入80％乙醇逐步脱水，室温放置10min
   吸弃溶液，加入95％乙醇逐步脱水，室温放置10min

吸弃溶液，用干净干燥的滴管换上丙酮，更好新的吸管是因为怕吸管潮，清洗3次，每次10min。注意回收废旧丙酮。此步动作要快，否则会在样品表面产生空气膜，影响脱水和下一步渗透的效果。

吸弃部分丙酮，滴入包埋剂，丙酮：包埋剂约=1：1 ，室温保持1hour。（陈老师）最好不要在这一步去吃中午饭，休息。因为这步还有丙酮，丙酮会导致样品变脆。所以，这一步最好还是1小时后，准时换成100％的包埋剂，然后可中午可以休息一下，放久一点没关系。

吸弃溶液，加包埋剂适量，室温1hour，共加三次，每次1hour。最后一次换包埋剂后放置过夜。

第二天早上8点或以后，这一步时间不是很准确的。

将样品名称和日期等写在硫酸纸上，正面向下放入包埋板的小孔中。往包埋板内倒入少许包埋剂。用牙签挑起一小块样品放到包埋板内,每一孔的两端各放一小块。然后将包埋剂倒满包埋孔,尽量避免产生气泡。

在干燥的空间内室温放置1－2小时后，也可放在通风厨中半天，注意，包埋剂在聚合前也是有毒的，所以，包埋前尽量放在通风厨, Spurr包埋剂用70℃的温箱中聚合8－10小时，Epon包埋剂则用60℃的温箱中聚合12－24小时。也可试一下，把样品放到包埋块后，不要马上到烘箱中聚合，而是放在室温内半天到一天，晚上在放到烘箱中过夜。一般在烘箱中不要放置太长时间，聚合时间够了后，拿出来，保持在室内就行了，如果在烘箱中时间过长，也会导致脆。此外，要检查一下烘箱的温度是否正常。聚合时一般把包埋块放在烘箱的上层，因为测温系统只测上面，而电热丝在下面，所以下面的温度会比显示的要高。所以，要放在最上层聚合。

如果切片时发现，样品内有气泡就是脱水这一步没做好，应延长脱水时间，使用干净吸管或枪头。如果紧贴样品周围有气泡，就是从丙酮转移到包埋剂这一步太慢，导致样品周围形成了空气膜，这种情况就要将样品换溶液时动作迅速点。在丙酮和95%的乙醇中，可以先小心到出上面溶液，然后用小一点的枪头（200ul）吸剩下的溶液，迅速加入下一步的溶液。如果不是紧贴样品，而是发现整个包埋块随机有气泡，就是配置包埋剂溶液时搅拌速度太快。

• 切片前的准备工作：

准备放有足够格数的滤纸的培养皿和足够数量的铜网，（刘哲）一般来说一个样品大概捞3－4个铜网刚练习时，步熟悉，每个样品可捞6个左右，但熟悉了，每次只要3－4个铜网就够了。每次都要记住样品贴的那个面。，注意铜网的反正面，反光那边是正面，准备铜网时把铜网全部正面朝上。

制刀:过程中注意用小刷子清扫玻璃渣子。（我记不住每一步的写法了）

一、制造矩形玻璃块：

   通过仪器左侧旋钮把后玻璃架锁住，把划线杆推到底，划线选择器放在矩形玻璃块的位置，使该符号向上；
   放一条玻璃条在仪器上，并把前侧扳断旋钮逆时针转到底；
   将玻璃条推向圆柱的同时，用手握紧玻璃条；
   降低索头直至压紧玻璃条，放手并把叉垫于玻璃条末端；
   拉出划线杆进行划线，然后顺时针方向转动扳断旋钮，扳断玻璃 ，随即把旋钮位置复原；
   把索头升起，把划线杆推回原处，并用叉将矩形玻璃块取出；
   重复1-6，直至获得所需要的矩形玻璃块。

二、制刀：

  1，   重复制造矩形块步骤1，只不过将划线选择器放在25的位置；
  2，   放一矩形玻璃块在两个玻璃架间，将矩形块的两个对角正对两架；
  3，   将左侧旋钮顺时针方向转动到底，使后玻璃架夹住玻璃块，再向玻璃块移动前玻璃架将矩形玻璃块夹紧；
  4，   重复制造矩形玻璃块步骤4-5；
  5，   把索头升起，把划线杆，前、后玻璃架推回原处，用叉取出两把玻璃刀；
  6，   重复以上步骤，直至获得所需要的玻璃刀。

三、粘水槽。（刘哲）应在切片前半天制刀，并用指甲油粘水槽，这样就有足够的时间令指甲油干燥。

• 切片

一、修块：

选择合适的支架将准备好的样品块夹紧，并将支架固定于底座。

将散光灯打开, 用刀片进行修块。先用稍旧的刀片修到贴近样品，然后用新的锋利的刀片切上表面成一光滑的平面，然后再把四周修成梯形状。注意梯形上下底一定要平行。（刘哲）另外梯形的上下底之间不要过窄，会影响切片效果。

将修整好的样品块连同支架固定于样品定向头上，调节高度至大约与标杆同高，准备对刀切片。

二、玻璃刀的准备和检查：

将玻璃刀固定与标杆同高；

打开聚光灯（focused light），拉出灯架上的镜子，并调节起位置使其光聚集在刀刃上，将显微镜位置调节至合适位置，观察检查；

选择具光滑刀刃的刀，用石蜡或指甲油粘上水槽，备用。（这个步骤和刘哲的不同）

三、对刀及超薄切片：

将准备好的刀固定于刀架上，调节高度和间隙角(一般不要轻易老调间隙角，只有在确实觉得非常困难，想不出有别的办法了，才调节间隙角，我不知你们调动了没有，一般不能太大)如果切片时，样品老带水，而你发现切片没有碎屑粘在刀上，那么可能间隙角太小，但太大，等于刮样品下来了，很容易造成颤纹等缺陷）；

打开diffuse light，调节显微镜和diffuse light的位置，松开定向头调节部件，调节样品高度及方向，并同时调节刀的方向，使样品面平行边与刀刃平行，样品面与刀垂直面平行，直至样品面反光亮斑在free样品臂后，用MANUL上下移动样品臂时一直保持同宽。

将刀向前移动（先用粗进轮，顺时针转动，再用中、小轮）至样品面上的光斑变窄至消失。 调节diffuse light和显微镜位置，用针筒将蒸馏水注入水槽至水面与刀刃基本水平并能在显微镜中看到反光面。

设置cutting speed到2mm/sec，Feed 调到OFF，将操作杆打至AUTO。继续移动刀架至切到样品，打开FEED，调节电流至切下的片的颜色合适为止，连续切片至合适量，准备捞片。

（刘哲）夹住铜网一侧，稍微令边缘弯折，使铜网和镊子成一定角度，方便捞片。一般来说一个铜网大概捞四个切片要看你修块的大小，很难说，。用睫毛笔把需要捞的切片聚在水槽中间如果你修块时注意梯形上下边平行，而且完整，这个时候应该是一条带，捞片也就变得很容易了，否则是比较困难，然后用镊子把铜网先插进水里润湿，再由下往上捞出切片。然后用一个滤纸在铜网背面吸掉多余的水份，再对准培养皿对应的格子的外侧，用滤纸沿着镊子中间往铜网方向轻轻推进，令铜网掉落（这样很容易把样品的面搞反，你放的时候一定要小心，否则染色就染不上，尤其有支持膜的铜网）。

注意事项：

   切片机电源接通前，各部位应处于关闭状态；
   连续切片时，应每隔1小时停机，吹风10-15分钟后，方可继续工作；
   必须严格检查玻璃刀的质量；
   切片结束后，按顺序关好各开关，才能切断电源；
   离开之前，需要用湿布抹干净。

   （小黄）刀用完后尽快把水槽拔下来，放久了不好拔。

• 染色（刘哲）

1、切片后铜网至少放置半小时，才能染色，否则切片容易掉落。

2、把铜网夹到染色板上，用纸记录清楚每个位置所夹的铜网是哪个样品的注意样品在那个面，朝哪个方向。用枪头吸铀染液滴到每个样品中，由于铀染液见光分解，所以用盒子盖住。染30分钟。

3、冲洗，可以用蒸馏水瓶对着染色板缓慢冲洗，最好不要对着铜网直接冲洗。或者用烧杯准备2－3杯蒸馏水，把染色板放入每个烧杯中大概浸洗50次左右。

4、在蜡板上放氢氧化钠，氢氧化钠主要的目的不是吸潮，而是跟柠檬酸铅竞争跟空气中的二氧化碳反应，所以，在吸取和去掉柠檬酸铅染色液时，能不呼气就不呼气，尤其避免讲话，把染色板放在中央，用枪头吸铅染液滴到每个样品中，马上盖上培养皿的盖子。因为柠檬酸铅染色液很容易和空气中的二氧化碳反应，所以，一定要马上盖盖子。染15分钟后同上步骤冲洗，然后把铜网重新放在培养皿的对应格中，靠内侧放，作好标记，一般我一个样品捞4个片，每次染色，每个样品染两个，如果观察时，觉得样品有污染，不好，可用另外的再染，刚做时，可多切几个铜网，染好色的铜网可用另外的培养皿或样品盒装，避免把染色了的铜网和没染色的铜网混淆。

6、今天又想起昨天刘哲还说了一个问题，因为有个切片切下来时中间有一圈看上去有点皱的圈圈，他说可以试下用一种什么试剂熏一下，令它展开。可以的吗？那瓶试剂就放在切片机旁，是什么试剂来的？

是可以用那溶液来熏，用时用滤纸沾湿，然后在水面上面轻轻移动。千万不要把滤纸碰到水，但太远，又不起作用，一般我在显微镜下操作。

7、想问问间隙角是指什么？我都不知道有没有调过呢，是刀架绕着样品旋转的角度还是刀和样品间的角度？搞不懂，只是如果拿旧的样品来切时，有时会出现样品臂下降不足够而不能重新抬起来，刘哲怀疑是样品平面修快是没有与块状的边缘垂直的缘故，导致对刀时旋转样品和刀的角度时令样品那边的座旋转过低。我也不知道怎么形容，下次回去拍个照片给你看看。

在旧电镜的墙柜中的最左边，不是有很多说明书吗，其中一本是旧的切片机的说明书，你看一下会收获很多，那上面有图讲什么是间隙角（好像英文是clearance angle)。

样品臂下去抬不上来的原因是把刀位置放得太高，样品的中间和刀刃以及标志杆要尽量同一高度就不会有这样的问题了，就是你先锁住样品杆，把样品放好，再加刀，然后在刀架的左边有个黑色的小杆可以放下来，可以抬起来（我不知他们是抬在上面还是放下来的，很小的一根），一般这是个标志的杆，目的是让你把刀、样品都放在同一高度。一般跟修块的关系不是很大，如果样品块不是垂直，你可以在对刀的过程中调整。这个过程是比较难学的。但愿你成功