电子断层成像技术
上述讨论的蛋白质电子晶体学和冷冻电镜单颗粒技术中所研究的对象都被认 为具有全同性的，即所研究的同一种生物大分子中，每个个体都是具有完全相同的 三维结构的。然而实际情况并非经常如此。有相当多的同一种生物大分子中每个个体结 构并不完全相同的，就不能使用上述两种方法，而需要使用新的技术来研究它们的结构。 这就是电镜断层技术。断层技术可以分为两种方法，一是电子断层技术，二是连续切片三维 重构方法。
未来细胞生物学研究中生物学家可以拍摄到整个细胞的美妙图片，他们可以任意缩放单个蛋白的分子结构。但 他们还没有找到观察细胞肌动蛋白丝和高尔基体等中等大小细胞器立体结构的有效途径。现在，通过一种可以 产生细胞器完整三维图像的技术为观察这些结构打开了一扇窗户。这 项技术称为冷冻电子断层成像术（cryoelectron tomography，cryo-ET），是由德国Max Planck生物化学研究院的Wolfgang Baumeister发明的。他的研究小组报道了应用cryo-ET技术 捕捉到变形虫Dictyostelium discoideum中肌动蛋白丝的网络图像。这些图像为研究完整细胞中的肌动蛋白几何学提供了第一 个结构测量法。这项技术的工作原理与医院中使用的CT扫描有点类似。具有穿透性的放射线产生二维 的图像"切片"，计算机可以将这些二维图像组装为三维图像。虽然通过二维图像组装三位图像的概念 30多年前就已存在了，但直到最近的技术突破才使研究人员可以足够快速地获得数据来防止电子束损伤细 胞结构。不同于传统的技术，cryo-ET无需染色、固定和细胞膜破碎等步骤，而这些步骤都会产生矫作物。 所谓矫作物是指非正常出现而是由外界因素或作用所产生的一种结构或物质，如经固定后，在显微镜下才 能看到的标本中的一种活生命组织中不会出现的结构。Cryo-ET使细胞结构分析的新方法的诞生成为可能。 例如，Baumeister的研究小组希望能够创建所有真核细胞细胞器的三维图谱，并利用这些图谱首次揭示核磁 共振成像与X射线结晶术观察到的原子水平图像与光学显微镜观察到的细胞水平图像之间的整体联系。这项 技术对于捕捉细胞边缘部分的细胞器如高尔基体、微管纤毛以及鞭毛等尤其具有潜力。Baumeister的实验室 已经证明cryo-ET的灵活性。这项技术经过进一步改进，将会更加经济 简便。"未来10年左右，cryo-ET的使用将经历一场大爆炸。"Purdue大学的显微镜术专家Timothy Baker预言。"它将成为细胞生物学研究领域的主力军，这一点毫无疑问。"
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冷冻电子断层成像技术
冷冻技术在前面章节中已经做了详尽的论述，这里着重于电子断层成像术，它主要用于研究那些单一结构, 比如细胞或细胞器,以及一些巨大的超分子复合体。这些体系的特点是粒子本身并不具有全同性,不可能采 取单颗粒研究中的平均方法来提高信噪比,所以这种方法的分辨率并不高,现在最好只是4～5ｎｍ。 它的主要策略是对同一个粒子每隔一定的角度间隔拍一幅照,这样就得到了几十幅代表同一结构在不同角 度下的投影像,然后再对这一系列的投影对正后,用加权背投影的方法得到原来粒子的结构。这个方法本 身有一对矛盾:一方面为了保证信息的完备,需要样品在较大的倾转角度范围内以较小的步长拍照,这就不 可避免地要使用较大的电子辐照剂量;另一方面,为了保证图像反映真实结构,需要样品承受尽可能少的电 子辐照。这对矛盾只有在现在自动控制的电子显微镜和自动数据采集系统的运用后才得到较好地解决。 电子断层成像术的主要优势在于解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构,如线粒 体、高尔基体、细胞等,这些不具全同性的粒子结构是无法用其他方法解析的。而低温技术在电子 断层成像术上的应用,使得人们可以直接看到整个细胞内的结构和动态变化,从而可以用于研究亚细胞量级的 生物学过程。如Ｂｏｈｍ等人对Ｔ5噬菌体是如何将ＤＮＡ释放到宿主细胞中的过程进行了研究,他们对体 外重组的噬菌体-脂质体系统进行了低温电子断层成像和结构分析,揭示了噬菌体尾部在和膜上受体结合后的 结构变化和一些结构细节。最近Medalia等人用电子断层成像术重构了网柄菌细胞 (dictyosteliumcell)的胞质结构,从中可清楚地看到以肌动蛋白为主的细胞骨 架系统和细胞膜以及胞质里的一些大分子的空间连接关系。
技术路线
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{chap12ET} \caption{生物组织电子断层三维重构过程\label{chap12ET}} \end{figure}
电子断层三维重构方法利用样品架的倾斜得到组织样品的不同倾斜角度下的二维投影图像，继而确 定这些二维投影图像的取向和中心位置，再利用中央截面定理把大量的的组织颗粒图像空间叠加重 构出组织的三维结构。至今已经用此技术得到了大量组织颗粒的三维结构。 一般而言，电子断层三维重构过程包含上图\ref{chap12ET}所示的四个过程：前面两个过程在上面章节 种已有论述，这里着重讨论后三个过程。样品中心和取向的确定目的在于找出不同倾斜角下的投影图像在 傅立叶空间的方位；以便进行三维结构的合成。三维重构和三维显示的任务在于投影图像在空间的叠加方法， 以及计算机的可视化手段；三维分析与解释是对重构图像的结构的预测与结构功能关系的说明，其中包含了大 量的图像处理的内容，图像分割是对结构解释至关重要，图像配准和目标提出目的在于将组织的序列图像在空间 对齐，以便在计算机上进行叠加时，能够反映出组织真实的空间结构状态。
电子断层三维重构方法
最早的电子断层重构方法的研究是在傅立叶空间方法去进行的重构，继而发展出的实 空间背投影技术（real-space back-projection technique）逐步成为应用最为广泛的技术。它是Rademacher提出的，简称为WBP方法。顾 名思义，背投影方法即是将每个二维投影图像背向其记录时的倾斜角方向投影到三维空间中，很多 背投影图像在三维空间中叠加形成样品的三维结构。即使在每幅图像中频率取样时统一的，单倾斜的 几何特征决定了在重构样品的低频会出现过采样，高频部分也有类似的情况。通过简单的权重滤波器能够 实现取样平均的目的。
另外一种三维重构方法是在70年代早期发表的迭代重构方法，其应用也在逐步扩展。它基于一个前提：重 构样品背着起始投影角的重投影应该与原图像一致。这类方法括:ART(algebraic reconstruction technique)和SIRT（simultaneous iterative reconstruction technique）。以下对上述方法分别进行讨论。对于复杂生物样品的ET成像，是用单轴倾 斜来进行投影数据的获取，如图\ref{chap12tilting}，单轴在倾斜范围（一般±60或±70）内逐 步增加（1－2°）从而获得在不同倾斜角下的序列投影图像，用CCD或照相对进行图像的收集。有 时为了对样品整体进行成像，将样品旋转90°再进行一次上述的成像获得另一个角度的序列图像。一 般ET的投影图像的数量为60－280张，由于分辨率的要求，投影图像大小为1024×1024 到 2048×2048象素。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=6cm]{chap12tilting} \caption{单倾斜轴数据获取几何图形。样品在显微镜下通过一定的倾斜范围（一般±$60$或±70） 结果一系列重构所需要的投影图像被采集\label{chap12tilting}} \end{figure}
WBP方法以下述方式进行，它假设投影图像表示了投射光线所遇到的所有物质密度的总和。这个方 法简单地分配样品的量以表示计算的背投影光线。在这个方法中，样品的量背投影到重构体中。当 这个过程对一些列从不同倾斜角度记录下来的投影图像重复运用时，从不同图像上来的背投影光线 彼此交叉增强，得出样品三维空间量的结构。因此，样品我们从二维投影图像上重构出了样品三维的 量的结构。背投影的过程包括固有的低通滤波致使所重构的结构模糊增强。事实上，为了补偿背投影 的传递函数，需要对投影图像事前进行高通滤波处理（权重），因而，这便是其名称权重背投影的由来。 图\ref{chap12projection}示出了背投影的重构。具体算法描述见参考文献。这个方法的缺点在于， 1.其结果受有限的角度数据所造成的缺陷影响较大，2。WBP没有考虑HVEM（high-voltage electron microscopes）的传递函数和噪声条件。作为补偿后处理技术（如低通滤波器）需要应用来 消除这个方面的影响。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=6cm]{chap12projection} \caption{投影图像反向背投影到样品三维空间中形成样品的三维结构\label{chap12projection}} \end{figure}
另外的三维重构技术，序列扩展重构方法蕴含了一些内在的调整特性，来面对有限的角度数据 和极大的噪声条件。但是均因为较大的计算量而难以实用。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=5cm]{chap12WBPandSIRT} \caption{在简单条件下比较：左边是需要重构的模型；中间是用WBP方法所做的重构；右边 是SIRT方法所做的重构\label{chap12WBPandSIRT}} \end{figure}
图\ref{chap12WBPandSIRT}说明了WBP和SIRT在简单，无噪声情况下的重构。左边是一个人造的 生物大分子的复合物；通过倾斜轴在[-60,+60]的角度范围每2°倾斜变化，得到61个投影图像。 用WBP和SIRT方法对这些投影图像进行重构，中间的为用WBP的重构结果，右边的为SIRT迭代100次 的重构结果。由图可见，WBP重构中，因倾斜数据不足造成在旋转轴沿Z方向的数据缺失。对SIRT没 有明显的缺失，但是，SIRT的处理时间是WBP的两倍。
电子断层三维分析技术
对于生物组织的结构的分析解释是近年来又一个研究热点。由于电镜分辨率不能达到原 子水平，所以通过图像处理方法，对生物大分子的结构进行高分辨率预测成为一个新的， 充满活力的研究方向。例如从单颗粒技术和电子断层三维重构的结果来进行生物大分子的 二级结构的预测。从蛋白质结构的特征出发，应用图像处理技术在三维重构的电子云密度图 中进行α－螺旋，β－折叠的结构的预测和分割提取。如图\ref{chap12ETanalysis}[13]， 四种样品为]噬菌调理素(1C3W)；]丙糖 磷酸盐异构酶（1TIM）； 胰岛素酪氨酸激酶 (1IRK) 蓝舌病羊病毒衣壳蛋白 (1BVP) 第一列为他们的原子结构；第二列为从冷冻电镜单颗粒技术三维重构密度图中分割出的局 部区域；第三列为用图像处理方法在结构中找到的 α－螺旋，β－折叠；第四列为软件找到的结果和大分子的二级真实结构的比较。可见通过 图像处理中的分割技术，从电镜三维结构中对生物大分子的二级结构进行了预测。这个方面的 研究方兴未艾，这个技术将开辟从电镜数据进行计算机分子模拟研究新领域，对药物开发提供 新方法。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=8cm]{chap12ETanalysis} \caption{电子显微三维分析技术\label{chap12ETanalysis}} \end{figure}
电子断层三维成像技术有望成为原子分辨率X-ray 晶体衍射方法与细胞水平的光学显微镜方法之间的桥梁。它已经成为研究大分子复合物， 细胞器，完整细胞等生物结构的有力工具。ET成像中，样品厚度一般为50-150nm, 为穿透厚样品，电镜工作高压大约为300－500KV，容易造成样品的辐射损伤，应用冷冻电 镜技术对样品起到一定的保护作用。加之ET成像三维重构技术的样品准备过程较其他方法更 加简单易行。因此，这个方法成为纳米级生物样品研究中不可取代的方法。 分辨率低以及重构过程计算复杂费时是ET技术难以实际运用的重要障碍。当前的研究着重于电镜本身性能的提高，并用图像处理技术来提高重构三维图像的分辨率。采用计算机并行运算，能够很好的解决三维重构过程中运算量大的问题。
连续切片三维重构技术=
这种技术适用于0.5μm至数μm之间大的分子复合体和亚细胞结构。 许多生物组织的显像、超微立体结构一般是人们观察了大量的该结构的二维图 像后在脑中"重建"起来的。连续切片的计算机三维重建技术是对某一细微结构进 行连续薄切片,然后把这一系列切片的图像,通过计算机进行处理,从而得到结构的 立体形态的一种方法。这种方法首先由Sjostrand(1958)论证了可行性和可靠性。 而较为实用的方法则是由Hillman(1977)解决的。多年来,不少研究人员一直致力于生 物组织连续切片的三维重建和三维显示工作,以求进一步完善二维切片图像的三维重建 理论及进一步提高重建速率,改善显示效果,扩大应用领域。三维重建技术在阐明生物体 组织结构与生理功能之间的关系以及在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域的研 究中有着重要的意义。
目前,国际上正在继续进行广泛深入的研究,在国内也引起了广泛的注意。三维图像的 定位连续切片的计算机三维重建多数是对肉眼可观察到的实体如脑、颅骨、神经、心 脏[2,3]等。显微生物组织图像的计算机三维重建是新的研究课题,目前这方面的报道较 少。除了显微结构在重建中的一些固有困难外,定位问题则是三维重建中的共同难题。定 位,也称对位、配准(registration),就是确定图像像素点在空间的位置,从而将二维序列 图像合成三维图像。目前,主要有以下几种方法:(1)利用细针、激光或微电极穿孔[4]。大 多数定位是穿2～3个孔。用这些基孔,以实现切片对位,这种方法较为常用且简便,但也存在 缺点。首先在不知道组织内部结构的情况下,随意穿孔可能破坏需要的结构,影响重建结果。 虽然对于半薄、超薄切片可将孔打在标本块的包埋材料上,但在进行三维重建时需要的是极 小的一部分,这样在高倍放大的情况下,穿的孔可能在我们的视野之外。这对于打在材料上的 孔有着同样的问题。其次,基孔在高倍放大时可能不完全一致且会产生垂直误差;(2)根据对生 物组织解剖学的先验知识而判别[5],此法简单易行,但需要有丰富的解剖学知识且易使边界模 糊;(3)把标本块所要切的面用修块机修平或用刀片切平,侧面修成平面[6]。由于切面平行,因 此在进行图像输入时就可以对图像进行定位。但在所需要的视野内也可能看不到切面的边缘。 以上3种方法称为硬定位。目前较为精确的方法是软定位,即通过语言编制的计算机定位方法[2]。 这种软定位结合硬定位,定位精度较理想,但人机交互工作量及计算量均较大,还有待改进。正确地 判读切片数据和将切片图形准确地对齐,是连续切片三维重建的重要步骤。它直接影响着重建结果 和参数计算的准确性。这个问题目前还没有很好的解决方法。无论是硬定位还是软定位,都有待完 善,使其更易操作,定位更精确。
三维图像的重建与显示是根据组织连续切片图像在量化过程中被赋予的相应的深度信息 和变化,将物体不同切片上的二维图像数据按照切片的空间位置关系依次叠加排列而成物 体的三维数据;再利用计算机图像处理技术、图形生成理论及视觉心理学原理,在二维平面 上形象直观地显示出具有生动性和立体感的三维图像。目前国际上由断层生成三维图像的 方法主要有以下几种:(1)线框模型法(wire-framemodel)。它是将切片中的物体轮廓线提 取出来组成经纬线,产生网状结构的三维物体图形的重建法。用这种方法形成的三维图像直观 效果较差;(2)立体图对法(ster-pair)。该法是将处于不同深度层次的组织切片轮廓按照双 眼视差原理重叠在一起,然后用双眼立体镜对重叠图像聚焦而获取三维图像的一种方法。这种计 算机三维重建方法得到的立体构形比较准确,但没有立体镜则难于观察(少数人不用立体镜也可以), 与立体图对类似的形式是红绿二色立体图;(3)灰度表面模型法(shade-surfacemodel)。此法首 先利用多边形逼近物体表面,再通过隐面消除、明暗处理等方法获得立体感强的三维物体图形。 其三维模型具有形象逼真,立体感强,观察方便等优点,但实现起来困难较大,重建时间长;(4)体素 模型法(voxelmodel)。它是以单个小立方体,即体素作为三维图像的基本单元的一种重建方法, 其特点是保留了重建物体的内部特征。这种方法重建结果形成一个三维立体结构,可以显示任意剖面 图像,但重建时间长;(5)深度彩色法(depth-color)。此法的基本原理是对切片图像进行彩色分 割,即用不同的色彩对不同的组织块图像进行编码,并对不同层次的组织块赋予不同的颜色、饱和度 和亮度,利用颜色由淡到浓给人以由近及远的深度感觉。此法重建算法简单,易于硬件实现重建速率 可接近实时,对任意复杂形状的物体均可重建,因此使用范围广,但由于人为地为组织指定颜色虽提高 了人眼对彩色的敏感性,却隐藏了组织内部的某些信息;(6)真实立体图像显示法。此法是利用光 学原理和人眼视觉暂留特性的一种三维重建方法。其图像直观、立体感强;(7)截面重建法。这种 方法是利用画面上像点的明暗程度来表现模型可见表面各部位的深浅而使人产生立体感觉的一种三维 重建和显示方法。可观察物体不同剖面,算法简单,重建速率快,使用范围广,但旋转显示的可视侧面效 果差,立体感不明显;(8)基于三角形面元以及NURBS(非均为有理B样条)曲面的三维重建方法。这 种方法根据三角形面元以及NURBS曲面的三维重建算法,并将模式识别的原理和模式分类方法引入多目 标识别过程,从而实现对多目标离散体或任意复杂形状物体的三维重建。此法获得的图像直观效果好 但计算量大,重建时间长,而且显示的只是物体表面,难以显示出实体剖面图像。上述重建方法各有利 弊,且大都是针对不同的研究对象而提出的,因而均有一定的适用范围。随着计算机图像的发展,已有 不少用于三维重建的软件,如ColumbiaScientific公司研制的CS1/3D软件,3-D-E,3DVIEWNIX,AVS等。 但有很大的局限性,不能广泛应用。近年来可进行三维重建动态显示的仪器也陆续问世。例如共聚焦 显微镜,这种仪器可以断层扫描样品,然后三维重建,并且可测量形态参数,用菜单和鼠标操作即可。此 仪器使人们避免了繁重的连续切片工作、但由于其切片厚度最小为0.1μm,所以对于超微结构的观察, 还必须进行连续切片。
图像压缩重建后的三维图像数据是用来在计算机屏幕上进行立体感显示的,要对它做各种几何变换 的运算,实现多种投影显示方式及几何尺寸的测量等,这就需要在计算机中存储和操纵庞大的数据, 所以必须统一地考虑数据在内存的压缩存储格式和各种快速算法。从压缩种类上看,图像压缩可分 为两大类。(1)无损压缩,即原始图像可以从压缩中完全恢复出来。此种方法是以信息论中的保熵原 理为基础的。其缺点是压缩比较低,一般情况下不超过3。(2)有损压缩,这种方法压缩比较高,但是以 图像的信息损失为代价。从压缩方法上看,自Oliver提出PCM编码以来,图像编码技术得到了迅速发展 和广泛的应用并日趋成熟。传统的编码方法有:熵编码、游程编码、预测编码、变换编码及分层编码 等。进入80年代后,相关科学的迅速发展和新学科的不断涌现也为图像压缩技术注入了新的活力,为了 能更好地满足计算机多媒体的需要,人们结合模式识别、计算机视觉、神经网络及小波理论等,开始探 索图像编码的新途径。现在矢量量化编码、神经网络编码以及小波变换编码等压缩技术已成为人们研 究的热点,这一研究已取得令人鼓舞的成绩,它们作为新一代编码技术的代表将被人们逐步完善。同时 人的视觉心理生理特性的研究成果也开拓了人们的视野,给从事图像编码技术研究的学者带来了新的启 迪,产生了基于人类感知的图像压缩编码。这种压缩技术不局限于Shannon信息论框架,具有高压缩比。 当前这种编码技术正在发展研究之中。从目前的发展趋势看,在不远的将来会有更多的图像压缩技术应 用到生物图像领域中来,各种编码压缩技术也会不断地得到发展完善。
三维图像必需考虑实体中哪一个部位应被成像,因此需要对图像进行分割。按物体对图像进行自动分割 是一个尚未解决的问题,然而这一问题的解决对实际应用有很大的推动作用。自动分割技术,国外从80年 代后期开展这方面的研究。Naziflevin提出一种基于规则的图像分割的方法,这种方法虽实现了图像的自 动分割,但有很多弊端。随着人工智能技术的发展,出现了基于知识的图像分割方法。这种显示方法保真 度较高,同时也避免了三维重建过程中遇到的图像匹配问题,是一种很有前途的新方法。但该法在很大程 度上取决于知识模型,而建立一个完整的知识模型是一个长期的内容。近两年BrighamYoung大学的ErieN. Montenson等人提出一套称为"智能剪刀"的方法。该法将自动分割与人工交互分割相结合,做到了既省事 又准确的对任意图像中的物体进行分割和编辑,有很好的应用前景。
技术路线
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{chap12SerialSection} \caption{组织连续切片三维重构技术步骤\label{chap12SerialSection}} \end{figure}
一般而言，生物组织连续切片三维重建过程包含上图\ref{chap12SerialSection}所示的四个过程： 前面两个过程在上面章节种已有论述，这里着重讨论后两个过程。图像配准和目标提取的目的在于将组 织的序列图像在空间对齐，以便在计算机上进行叠加时，能够反映出组织真实的空间结构状态；三维重建 和显示过程包括三维重建和三维显示两个过程，三维重建的任务在于建立显示模型，即用什么形式来反映组 织的三维形态。使用较多的显示模型有点和多边形，其中最多的是用三角形作为组织三维形态的显示模型。 三维显示是可视化的问题，即如何将建立的模型用计算机的方法显示出来。当前所使用的软件大多是基于表面 显示方法，通过OPGL开发工具所开发的显示软件。以下就组织切片图像三维重建显示种的图像配准技术以及三 维重建显示技术作详细讨论。
图象配准技术
按照配准时所依靠的图象特性的不同，可以把图象配准分为基于图象外部特性和内部特性的两大类配准方法。 其中，基于图象外部特征的方法包括定标架法、面膜法和皮肤标记法等；基于图象内在特征的方法包括手工交 互法、对应点配准法、结构配准法、矩配准法、以及相关配准法（即基于体素相似性的方法）等，这些方法都有 自己的特点。如定标架法，只要放置定标架就能实现图象配准而且定标点在图象中易识别，配准精度能达到象素 级的精度。但是，定标架的放置要求较高，往往需要与成像组织紧密接触，甚至对样品产生一定程度的损伤。而 基于图象内在特征的方法就不存在这个问题。如基于体素相似性的方法是基于图象中所有体素的配准方法。在成 像前和成像后都不用对组织和图象进行特殊处理，而且它是完全自动的。这种方法比较稳定，能获得准确的结果。 但是，这种方法需要大量复杂的计算，对计算机的性能要求比较高，耗时比较长，所以近几年才转入实际应用。
近几年来，又提出了一些新的图象配准的方法。Frederik Macs 等将信息论中的互信息量的概念应用于多模态医学图象的配准，提出以图象间互信息量作为配准准则的全自动配准
方法，配准精度能达到亚象素水平。随着小波变换在各个领域的广泛应用，它也被应用到生物医学图象的配准中， 它可以利用在低分辨率下的配准参数作为基础和引导，从而，得到高分辨率下更为准确的结果，这种层层细化、逐步 逼近的方法，不但有较强的鲁棒性，而且加快了配准参数搜索的速率，节约了配准时间。另外非线性配准也是近年来 研究的热点，它是基于一定数学物理模型，对图象进行非线形变换，以做到局部的精细配准，这对于非刚性对象的图 象配准更加实用，配准结果更加精确。
三维重建与显示技术
三维显示是手术可视化的基础，它也被称为三维真实感图形显示。它的方法为在计算机上完成建模后，用光照模型 和消隐处理算法在物体表面加入颜色、阴影、亮度、纹理等表面属性，从而使得整个景物模型更加真实。本系统所 涉及的三维显示技术指的是使用二维图象显示器，将三维数据以某种方式投影到显示平面上，通过对投影加明暗、 透视及旋转等方法达到三维的视觉效果。
实现三维显示的方法基本可分为两大类：即表面显示（Surface Rendering）和体显示（Volume Rendering）表面显示最早开始研究三维显示技术是面向多边形的表面显示技术。这种方法不需要得到全部体数据， 容许层间有较大间隔，只需要从每个新层图象上提取出表达同一实体的轮廓线，然后在一定的准则下连接两条相 邻轮廓线上的点，将实体连接的三维表面分解成一族多边形表面元。有许多种多边形可用来表达要重建结构的表面， 但研究的最早、最流行、最简单的是三角形表面元。早在70年代中期，由于放射治疗学的需要及计算机图形学的发展， 已经有人开始研究医学图象的三维显示。1975年IMB西德Heideberg科学中心的Kepple 第一次给出了实用图象轮廓线三角形表面元贴面算法。他是在图论理论的指导下搜索最优的贴面组合，以三角 形贴面技术来重建表面。他的算法首先将轮廓线分解成凸的子集和凹的子集，然后按排三角形贴面顺序，使凸 表面包含的体积最大。他将同每一个三角形表面元相关联的四面体的体积对应于一有向图；此三角形贴面的组 合可通过在图中寻找一条最大代价路径来获得。对三角形表面元贴面重建作进一步研究，主要研究贴面过程中， 三角形顶点选择的最优准则，由此提出了最小表面积法，最短对角线距离法等法则。在研究线性表面重建算法 的同时，所提出了非线性的表面重建算法。一般是利用在轮廓点一阶或二阶连续的自由曲面来拟合表面。面向 多边形的表面显示技术的优点是显示时计算量少、速率快，缺点是显示图象质量不高，且前处理所需要的工 作量大，而且有的组织结构很难自动跟踪出其边界，必须进行交互操作。最早应用于医学图象三维显示的技术， 它是通过平面元来近似和逼近显示物体表面，因而称为表面显示。具体做法是在三维体数据中跟踪和提取 等值面，然后将等值面分解成足够小的片面，以保证表面有足够的平滑度，然后采用计算机图形学的技术 和方法加以显示。医学图象中面向多边形的表面显示方法的具体步骤为：建立三维表面模型；用图形学的 方法对所建的模型进行显示。三维表面模型分为：面向多边形（Polygon Oriented）的表面显示方法和面 向体素（Voxel Oriented）的表面显示方法。面向多边形的方法是在每一层二维断层图象中提取边界， 得到由边界堆叠的 表面的线框表示，然后进行表面重建，通常是用三角形贴面技术，用三角形将层与层间的轮廓线连接起来， 然后进行明暗处理，得到立体感的三维表面。面向体素的表面显示方法是通过插值得到三个方向上分辨率一致 的体素数据，在体数据内以体素为单位跟踪表面，在构成表面的体素内进行小面片重建就，然后显示出来。 体显示在表面显示中，无论是面向多边形的还是面向体素的，其前处理都是很复杂的，而且它要求检测到的 轮廓线必须是几何上封闭的或空间上为拓扑连续的。如在某一个方向上的采样不满足采样定理时，要显示的 体数据中不一定包含器官的完整表面。而体显示方法则避开了这个问题，直接对体数据进行显示。它分为两 类，即直接投影法和光线跟踪法。基本的处理单元可以是体素（Voxel）和细胞（Cell）,其区别在于:体素内 的颜色与阻光度认为是一致的，而细胞内的颜色与阻光度被认为是变化的。以体素为处理单元容易产生块状 现象，因此，一般采用第二个模型以以产生高质量的图象。投影法将所有细胞按距视点的远近为序投影到二 维显示平面。根据显示次序的不同，显示方法分为两类：以图象空间为序的显示方法和以物空间为序的显示 方法。以图象空间为序的显示方法包括光线投射法（Ray Casting）和光线追踪法（Ray Tracing）。光线追踪技术通过跟踪多条光线在场景中的路径，以得到多个物体表面所产生的反射和折射 影响。而光线投射算法中，光线遇到最近的场景即停止跟踪。以物空间为序的显示方法首先给每个数据 点赋颜色值和不透明度值，然后给定观察方向和视平面，将每个数据点的坐标变换到图象坐标系中来，并 由光照模型计算出数据点处的光照，最后，将每各点对每个象素的贡献叠加起来，得到合成的三维图象。 体显示的优点是不必作大量的预处理，它适应于显示各种数据，且图象质量高。由于它将处理和显示操作 放在一起进行，使显示时操作的数据量大，显示的速率慢，对硬件的要求较高。
三维重建模型的建立
本文介绍用三角形和点来构建物体三维模型的方法：第一：将体数据分割出所需显示的点，由此点构建 显示表面。第二：MC算法及其改进方法。第三：点表面重构方法。
点模型显示
提取出的等值面由具有空间位置的点以及该点相应的法向量组成,利用计算机图形学的 方法通过设定光照模型,就可以计算出等值面上每一点的光强,然后就可以绘制出具有明暗 效应的三维数据场中的等值面。点显示存在一些缺点：通常的三维数据场并不能足够密集。 分辨率的不足导致显示的图象中存在空隙。解决该问题有两种方法，方法一是在提取等值面前 先对三维空间数据场进行插值，使数据场达到密集的要求，插值的方法可根据显示的要求来选择。 插值后等值点的个数得以增加从而消除了空隙，显示质量提高，但会降低显示的速率。方法二是利 用象素放大法，即认为增大每个等值点在光栅上的体积从而消除空隙，不影响显示速率，图象质量会 受到一定影响。
MC算法及其改进方法
MC算法将三维体数据视为局部线性连续。由函数的连续性，在局部区域[a b]连续，若f(a)>0;f(b)<0;则必有f(c)=0.如图二所示.。对于体数据MC算法用 一系列三角形拟合出一个微小局部Cube 中的等值面。由于一个Cube有8个顶点，每个顶点有正负两种状态，所以等值面如可能以$2^8=256$种方式, 通过旋转平移变换256种方法可归结为15种情况与Cube相交，如图三所示。在此Cube 中：加黑点象素的灰度值小于所给域值，其余各点均大于域值。则在三条边上进行内插得到等值面。 存在的问题：1。组成等值面的三角形片面数量较大，使显示速率受到影响；2。 Marching Cubes 的内插等值面存在二义性。使显示质量受到影响。
缩减MC 生成片面数的方法压缩原始数据可以减少输出的片面数，但是以丢失图象细节为代价的， 而用户往往需要观察图象的局部细节，因此，需要一种用较少的片面表示较精细结构的方法。 这就需要对MC算法进行优化。本文尝试了如下方法：
- 将所有体数据看成一个大Cube,并将它分为Cube1和Cube2；
- 对Cube1和Cube2分别用MC算法抽取出等值面Sur1和Sur2;
- 判断Sur1和Sur2能否用大Cube中的等值面Sur代替；如果Sur1+Sur2=Sur,就以Sur代替Sur1和Sur2,实现归并；
- 对Cube1和Cube2递归进行上述步骤，直至不能归并为止；
- 输出达到最大归并程度的Cube中的等值面。
具体方法：
Cube的剖分：采用沿Cube的最长边垂直方向剖分的方法，使得到的子Cube尽可能接近正方形，
由此带来的一个好处是生成的三角形的形状较规整，中心差分计算得到的片面法向量不至产生
突变，还可以较容易地制定剖分终止条件。剖分终止条件：规定当Cube
最长边不大于1时终止剖分，为了提高速率，剖分始终沿数据采样点进行。1为单位长度其实际长
度根据具体情况而定。
片面的生成：用MC算法提取其中的等值面，根据MC算法的假设，Cube的一条边可能存在多个等值点， 在这种情况下是无法用MC算法提取Cube中的等值面的，为此，作以下规定：对于Cube的一条边，用扫 描得到的第一对正负相临点计算该边上的等值点。作了这种规定后，就能用MC算法中的三角形构造表 生成任意Cube中的等值面了。
片面的归并：用MC算法分别计算出两个小Cube的等值面，然后判断父子Cube中的等值面是否相等，若是， 则用父Cube中的等值面代替子Cube中的等值面；否则，就使用子Cube 中的等值面。等值面的等同性是用等值链是否相等来判断。等值链相等的判断规则：如果两条等值链顶 点数相同，并且对应顶点之间的距离在精度控制范围内，就认为这两条等值链是相等的。归并条件: 1.对于多边形: d < prec(精度)。图\ref{chap12polygon }所示。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{chap12polygon} \caption{多边形归并\label{chap12polygon}} \end{figure}
若对于三角形: 设三角形S1,S2; 其法矢量为 ，设 其中T为三角形法矢量的方向域值, 为三角形法矢量的角度域值。归并条件为: 图\ref{chap12triangle}所示。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{chap12triangle} \caption{三角形归并图示\label{chap12triangle}} \end{figure}
消除Marching Cubes 的内插等值面二义性的方法：Marching Cubes是提取等值面的简单有效的方法。立方体的顶点物理量与等值面相比较，决定了顶 点与等值面的位置关系Marching Cubes方法根据这种位置关系，确定等值面形态，但是，许多形态不同的等值面与立方体 的顶点有相同的位置关系，即确定了顶点与等值面的位置关系后，并不能唯一确定等值面的 形态，这就是等值面的二义性。若要很好地解决等值面的二义性，我们需要考虑立方体内 物理量的分布函数，一般是三线形插值函数。
点表面模型
此法与点模型显示的不同点在于其重建模型仍然是居于分离体数（dividing cubes）的思想。其可行性在于对数据较密的生物医学图象多边形模型所产生的相当多的多 边形在可见面上的投影与点的投影几乎是等效的。如图\ref{chap12point}所示：将体数再 细分成倍a*b*c 更小的Cube ,Cube顶点的灰度值可由原顶点按比例线性内插得到。再比较Cube 各顶点与域值决定在哪个Cube 中得到表面点，从而建立表面模型。
Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{chap12point} \caption{点表面重构\label{chap12point}} \end{figure}
基于连续超薄切片的线粒体三维重构
本工作取一月龄健康小白鼠的肾细胞,固定包埋后使用超薄切片机按间隙角3 度进行连续切片,切片厚度约50nm ,用覆有Fomvar 膜的单椭圆孔的铜网捞起,染色后在本实验室JEM2100CX 型电镜上观察。选取切片中线粒体大小和数量均合适的一组切片进行拍照,底片冲洗出来 后用扫描仪将图像数字化,最后用计算机软件对图片进行处理。在三维重构阶段,首先要对切 片数据进行配准,由于本套切片图像没有明显的配准参考基点,且存在着不同程度的形变,因此 本工作在配准时,仅仅按照线粒体切片内部的最大相似性进行了线性平移处理,并没有进行非线 性的形态校正。其次对配准后的切片图像进行三维重构, 本工作分别IGLtrace 和专用以及上述的表面显示方法所编制的软件（CT3D）进行了处理。前者需要对线粒体的双层膜进行勾勒, 然后给出线粒体外部和内部形体的三维轮廓像;后者可以进一步给出线粒体三维密度像。处理结果如 图\ref{chap12mitochondra}所示。 Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=5cm]{chap12mitochondra} \caption{(a) 为IGL2trace 软件对线粒体内外膜三维轮廓放大图; (b) 为内膜三维轮廓放大图。图2 CT3D 软件对线粒体切片的密度图重建\label{chap12mitochondra}} \end{figure}
随着生命科学的发展和形态与功能研究的增强及计算机技术的飞速发展,用计算机技术直观地、
原位地、精确地展示被研究对象的三维空间构型的要求日益迫切。生物组织的三维重建显示正是应
这种日益增强的要求在近20年建立和发展起来的。现在生物组织连续切片的三维重建突破传统组织
学和形态学表达二维形态资料的局限性,为生物研究和教学提供了形象直观、立体感强的三维动态
图像资料及其形态学参数,因而不仅有助于对生物形状及其组织细胞进行完整且准确的形态学描绘
和鉴定,而且有助于阐明组织结构与生理功能、品质构成以及各组织细胞的空间位置相互关系。生
物组织连续切片的三维重建正越来越广泛地应用于形态学、比较生物学、解剖学、分子生物学等学
科领域。生物显微图像的三维重建一直是一个貌似简单容易进入而又非常棘手的研究课题。影响三维
重建图像效果的因素很多,除系统环境条件、重建算法与显示方法外,断层切片的数量和质量亦是影响
重建结果真实性的重要因素。由于组织细胞形态小,其连续切片的数量和质量保证难度较大,通常外形
重建效果优于组织细胞,所以从切片角度而言,还需完善。随着电子技术的发展,大量的生物组织图像将
建立在数字化基础上,如共聚焦显微镜、CT等。正在发展的数字电子技术着重完善图像的随机存取、传
递、再现以及处理、操作的简便性。从计算机技术角度来看,必须实现更复杂的软、硬件及图像工作站,
尤其软件设计必须在结构上突破普通关系数据库的束缚,允许处理图像,并通过图像与系统交流。
\begin{table}[htbp] \centering \caption{生物电子显微学研究方法分类}\label{table:chap12:ThreeTechnology}
\begin{tabular}{p{3cm} p{3cm} p{3cm} p{3cm}}
\hline
方法分类&研究对象&对象特点&样品分辨率\\
\hline
电子晶体学&二维晶体或三维薄晶&周期排列&二维晶体：细菌视紫红质0.3nm\\ &纤维或管状薄晶&&管状晶体：乙酰胆碱受体0.4nm\\ 单颗粒技术&病毒&全同粒子&病毒：乙肝病毒: 0.74nm\\ &单颗粒生物大分子以及复合物&&复合体：核糖体1.15nm\\ 电子断层成像术&超分子复合物，细胞器，细胞&单一结构&细胞：幻影细胞（phantom cell）0.40nm\\ 连续超薄切片三维重构技术&$0.6\sim 10\mu m$ 尺度的各种生物材料 &
单一结构 & $\mu m$ \\
\hline
\end{tabular}
\end{table}
综合上述几章的内容可见：应用蛋白质电子晶体学、冷冻电镜单颗粒技术、电子 断层扫描技术以及连续超薄切片三维重构技术，电子显微镜能够研究从较小的、具有周期 性排列的蛋白质晶体，到具有全同性的单颗粒，如病毒、核糖体等，直到无定型的超分子结构、 细胞器等三维结构。其分辨率从近原子水平的0.3-0.4nm直到几十nm。在如此广泛的范围和尺度进行三维 结构研究，这是目前唯一的方法，因而也成为研究生物体微观结构的最强有力的手段。随着各种方法不断 完善，其分辨率的不断提高，将会对生命科学的研究起到更大的作用、做出越来越大的贡献。
\begin{table}[htbp]
\centering \caption{\scriptsize
常用电子显微学图像处理软件}\label{table:chap12:software}
\begin{tabular}{p{2cm} p{3cm} p{3cm} p{4cm} p{1.5cm}}%
\hline
\scriptsize 软件分类 &\scriptsize 软件名称 &\scriptsize 主要用途 &\scriptsize 下载或联系地址 &\scriptsize 软件类型\\
\hline
\scriptsize 图像处理软件 &\scriptsize MRC &\scriptsize 二维晶体，螺旋结构 &\tiny http://iims.ebi.ac.uk/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize IMAGIC-5 &\scriptsize 二维晶体、单颗粒，断层成像 &\tiny http://www.imagescience.de/ &\scriptsize 商业\\
&\scriptsize Phoelix/Suprim &\scriptsize 螺旋结构 &\tiny http://ami.scripps.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize Brandeis Helical Package &\scriptsize 螺旋结构 &\tiny http://www.rose.brandeis.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize Spider/WEB &\scriptsize 单颗粒 &\tiny http://www.wadsworth.org/ &\scriptsize 商业\\
&\scriptsize EMAN &\scriptsize 单颗粒 &\tiny http://ncmi.bcm.tmc.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize IMIRS &\scriptsize 病毒 &\tiny http://hub.med.uth.tmc.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize SAVR &\scriptsize 病毒 &\tiny http://ncmi.bcm.tmc.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize BESPA &\scriptsize 单颗粒 &\tiny http://www.aist.go.jp/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize IMOD &\scriptsize 断层成像 &\tiny http://bio3d.colorado.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize EM-MENU &\scriptsize 断层成像 &\tiny http://www.tvips.com/ &\scriptsize 商业\\
&\scriptsize Situs &\scriptsize 接合 &\tiny http://situs.scripps.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize Xmipp &\scriptsize 单颗粒 &\tiny http://www.cnb.uam.es/ &\scriptsize 免费\\
\hline
\scriptsize 图像操作及 &\scriptsize Chimera &\scriptsize 三维图象显示 &\tiny http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ &\scriptsize 免费\\
\scriptsize 显示软件 &\scriptsize Pymol &\scriptsize 三维图象显示 &\tiny http://pymol.sourceforge.net/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize AIRS &\scriptsize 分子结构分析 &\tiny http://ncmi.bcm.tmc.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize EMTOOL &\scriptsize 图像格式转化 &\tiny http://sal.kachinatech.com/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize Suprim &\scriptsize 图像运算操作 &\tiny http://ami.scripps.edu/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize O &\scriptsize 三维图象显示 &\tiny http://origo.imsb.au.dk/\symbol{126}mok/c/ &\scriptsize 免费\\
&\scriptsize AVS &\scriptsize 三维图象显示 &\tiny http://www.avs.com/ &\scriptsize 商业\\
&\scriptsize IRIS Explorer &\scriptsize 三维图象显示&\tiny http://www.nag.co.uk/ &\scriptsize 商业\\
&\scriptsize CCP4 &\scriptsize 蛋白晶体学 &\tiny http://www.ccp4.ac.uk/main.html &\scriptsize 免费\\
\hline
\end{tabular} \end{table}