生物大分子的结构与功能研究是现代生命科学研究中重要方面，无论在理论或者实际应用上都具有重要意 义。生物大分子的结构与功能是紧密结合。测定生物大分子的高分辨结构对于了解其功能不单具有重 要意义，而且是必要的。尤其是随着人类基因组计划的初步完成，生命科学进入后基因组时代,阐明 了大量的大分子的基因序列后，需要继续深入了解这些基因如何转录、翻译、加工、折叠和组装从而形成具 有功能的结构单元。测定大分子的高分辨结构是其中必经之路。在本书前面所介绍的方法如：负染色 方法和超薄切片方法对生物大分子，尤其是生物大分子的复合体和组装体，例如病毒等，进行了大 量研究，积累了大量资料，作出巨大的贡献，但这些资料基本是形态学的，并且带有以下缺陷：①由 于是使用散射反差成像，其分辨率基本上在2.0nm以上，许多细小结构无法分辨；②基本上是表面形貌 的研究，没有涉及内部结构；③基本上是二维结构研究，没有涉及三维结构。对于生物大分子的结构研 究是远远不够的。

电子显微镜的分辨率已经达到原子分辨率的水平(如$0.1\sim 0.2nm$)。在材料学科的应用中已获 得了原子像，从分辨率的角度来看生命科学相比之下是远远落后了。其原因是应用电子显微镜研究生物 材料有许多特殊的困难：①电子束的辐射损伤，对于生物材料来说，电子散射大约3/4是非弹性散射，其 典型的电子能量损耗(亦即给予样品的能量)是20eV，已经超过碳链10eV的能量，因此，碳链往往被破坏。 Stem和Bahn测定表明：典型的蛋白质晶体在电子剂量为$1e^-/\AA^2$的数量级时就开始破裂。这样的剂量远 少于通常电镜观察时的剂量。②生物样品通常都含大量水份，当样品置于电镜的高真空时， 水份会汽化从而造成样品的结构发生变化--真空损伤。③生物样品主要由C，H，O，N等轻元素 组成，本身对电子的散射很弱，而且相互之间以及与水之间的差别也很小。因此，使得生物样 品电镜图像的反差和图像的信噪比很低。统计噪音往往大于信号，造成信号被遮盖了。正是由于 这些困难，造成生物材料的高分辨电子显微学的研究大大落后了。

在上世纪70年代，A.Klug，DeRosier, Henderson和Unwin等人首先采用一系列新的生物材料样品制备技术、高分辨的相差反 差成像技术和图像处理技术克服了这些困难。随后的30多年里，随着样品制备技术的 不断完善，电子显微镜的设备和技术的进步，计算机图象处理技术的发展，逐步形成了生物 大分子电子显微学，并成为公认的研究生物大分子结构的重要研究方法。这些方法的改进简单 地说主要反映在以下方面（电子显微镜本身和计算机图象处理的进步在相关章节作简介）：\\

• 采用快速冷冻样品和冷冻观察防止真空损伤。由于样品的水份低温中固化，在真空中不易汽化，并

且样品不经任何化学处理，因而基本保持生物大分子的自然状态；

• 使用低剂量技术（例如电子剂量

为$1\sim 10e^-/\AA^2\cdot S$）防止电子束辐射损伤。而且冷冻的样品也能提高样品抗电子辐射损伤的能力

（大约一个数量级）； *使用相位反差成象，从而获得高分辨图象；

• 应用中心截面定律获得样品的三维结构；
• 应用叠加或平均的方法提高生物样品图象的反差和信噪比。

由于生物样品本身对电子的散射能力差别很弱， 加上使用低电子剂量所得的图像反差和信噪比极差，信号被噪音所遮盖。因此，要想获得单个生物大分子的高 分辨率像实际上是不可能的。于是就使用叠加的方法。噪音是随机的，而信号是定向叠加，结果信噪比提高$\sqrt{N}$ 倍(N是叠加数)。这样就获得平均像（蛋白质X射线晶体学也是获得平均像）。对于蛋白晶体样品、可以采用衍 射的方法进行叠加而获得平均像，从而形成了蛋白质电子晶体学方法。而对于象病毒那样全同性的单颗粒样品， 只能采用计算机逐个叠加，从而形成了单颗粒技术。对于没有全同性的生物材料(这些生物粒子并非每个都完全相 同的)就不能够进行叠加了，而采用倾斜拍摄的办法，就形成了电子断层成像技术。这就是目前生物大分子电子显 微学中，各自独立而又相互联系的三种方法。

电子显微学方法在生物大分子的结构研究中，与蛋白质X射线晶体学或核磁共振技术相比较最大的缺点是分辨较 低。目前电子晶体学获得的最好分辨率是0.3nm(细菌视紫红质，1998)，单颗粒技术获得分辨率是0.68nm， （水稻萎缩病毒，2001），电子断层成像技术获得最好结果分辨率是4nm（影泡细胞，1999）。但它也有其优点：\\

• 适用范围广，蛋白质、病毒到超分子体系，晶体或非晶体，可溶的或不同溶的都可以进行研究。
• 样品制

备相对简单，由于使用急速冷冻方法，不用结晶且能基本保持自然状态，还能捕捉动态的结构变化。

• 由于 电镜图象包含相位信息，因而图象处理和三维重构较X射线晶体学简单，直接。

由于有了以上的优点，尤其是 对于具有非常重要生物功能的大的生物大分子复合体和组装体，X射线晶体学或核磁共振谱技术都是无能为力 的，而这样材料的结构研究正是电子显微学的特长。而且电子显微学分辨率较低的弱点正在被克服中。它的 分辨率的提高仍然存在很大的空间。最终，它的分辨率可能仅仅受制于生物大分子结构上的柔软性。因此有不 少国际权威学者认为生物大分子电子显微方法将会成为研究生物大分子结构的最强有力的手段。

目录 1 相位反差 2 电子衍射 3 样品制备 3.1 电子晶体学方法对样品的要求 3.2 碳微筛膜的制备 3.3 制样 4 低剂量高分辨衍射和成象= 5 计算机图像处理和重构

相位反差

无论是超薄切片技术还是负染色技术制备的样品，电镜成像都是使用散射反差，原因是样品比较厚对电子束的 散射较大，样品的不同结构对电子散射的差别能直接显示出来，从而能区别出各种结构，例如：细胞膜、内质 网、线粒体、细胞核等。散射反差的优点是通过各种结构对电子散射的不同直观地显示出结构来。然而缺点是 分辨率较低，例如通常低于lnm。如果样品很薄，例如厚度在20nm以下的由轻元素组成的生物样品，入射电子往 往未被散射便直接通过样品，或者只与样品中的原子的外层的一个外层电子发生碰撞--即一次非弹性碰撞。这些 电子的散射角很小（约$10^{-4}rad$）。散射电子几乎都能通过物镜光栏从而成为成像电子。因此由这些薄样品所形成 的散射反差就非常非常弱。然而，此时另一种反差却显示出来，它就是相位反差。

讨论相位反差需要应用光的波动传输理论。这里我们作一简单讨论。如果样品很薄，电子波通过样品 后，波的振幅不变而相位也只有很小的改变（例如薄于$20nm$的生物样品），就称之为\textbf{弱相位体}。 入射 电子波射到这样的样品后，一部分直接通过样品称为透射波，另一部分被样品散射形成散射波。如果物 镜光栏足够大，能让两束波都通过，则像就是两束电子波受到透镜的会聚作用后，相互干涉所合成 的结果。如果电镜的照明电子源是点光源，而且所发出的电子波具有单色性，则在像平面上的散射 波和透射波之间具有确定的相位关系，我们称这两束波是相干的，并且称这种照明源为相干光源。在这 种情况下，散射波和透射波在像平面处存在固定的相位差，则干涉后合成的波的强度与透射波的强度 存在差别，例如散射波和透射波之间相位差为$\pi$ 的奇数倍，则两者反相而相互抵消，振幅减弱。若相位差为 $\pi$的偶数倍，则振幅增强。这样在像中对应于样品中对电子散射的区域与不散射的区域的亮度不同， 于是就产生了反差。这种反差是基于散射波与透射波之间的相位差而引起的，故称为相位反差。下 面我们简单介绍一些结论。

散射波与透射波之间在像平面的相位差可以因球差和离焦的存在而产生：\\ （1）由于物镜球差的存在，引起两者之间的相位差：\\

    无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert):      Q_c=\frac{\pi C_s \lambda^3}{2d^4} 
\noindent $C_s$--物镜的球差系数； $\lambda$--照明电子波波长；

$d$--样品细节的大小。

（2）像的离焦也使两者之间产生相位差：\\
   无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert):      Q_f=\frac{-\pi \Delta f \lambda}{d^2} 
\noindent
这里： $\Delta f$--离焦量（$\Delta f>0$ 表示欠焦； $\Delta f<0$表示过焦）
        其余$\lambda,d$与上式相同。

由离焦引起的相位反差称为"离焦相位反差"，它与第一篇中介绍的散射反差中的离焦反差是不同的。

两项之和为总的相位差： 无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): \gamma=2\pi\lambda(\frac{1}{4}C_s \frac{\lambda^2}{d^4}-\frac{1}{2}\Delta f\frac{1}{d^2}) \label{equ:crystal:chi}

理论推导表明：这个相位差对图象强度的影响主要与$sin\gamma$ 有关，$sin\gamma$称为相应反差传递函数。由上式$\gamma$ 与波长$\lambda$ ，球差系数$C_s$ ，离焦量$\Delta f$ 以及样品细节尺寸$d$ 有关。在给定的$\lambda,\Delta f,C_s$的情况下，$sin\gamma$ 随样品尺寸$d$ 的改变在±1之间变化。

Image:.jpg[htbp]

 \centering
 \includegraphics[width=9cm]{fig_crystal_contrast}\\
 \caption{像的相位反差与空间频率之间的关系}\label{fig_crystal_contrast}

\end{figure} \noindent 图\ref{fig_crystal_contrast}给出 $\lambda=0.037\AA,C_s=1.6nm$时，离焦量$\Delta f$ 分别为$\Delta f_1=0,\Delta f_2=75nm,\Delta f_3=200nm$ 时，像的相位反差与样品尺寸$d$ 或空间频率（$k=\frac{1}{d}$） 的关系曲线。从图可见：相位反差随着样品细节尺寸 的变化而在±1之间变化。某种尺寸的细节产生正的反差，而另一种尺寸的细节产生负反差，还 有一些反差为零，即细节消失。这就引起图像解释的困难。为了解决这个困难，一种方法是选择 适当的离焦量使反差曲线有一个较大的平坦区。如图\ref{fig_crystal_contrast}(b)，$\Delta f=75nm$ 时，在0.4nm以上细节有一个较平坦负反差区域。这样对于大于0.4nm的图像解释就较简单。另一种 方法是对图像进行解调。这需要使用计算机进行。用计算机机解调首先要测定出离焦量和反差曲线。 其测验量方法最先由Thon提出：用计算机或光学衍射的方法对获得的相位反差成像的照片进行傅里叶 变换，其二维能谱称为Thon环。由于生物大分子的样品都由微筛碳膜所支持，而碳膜由碳微粒所形成。这些碳粒尺度和碳粒间距 离大致均匀分布于纳米尺度范围，对电镜的分辨率而言，可近似看从$0\to \infty$ 而且各向同性。因而傅里叶变换的结果获得明暗相间的同心园组成的图。明暗的环对应于反差曲线的极大 和极小。用简单的计算可获得照片的离焦量的和反差曲线。例如用光学衍射的情况：

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): \Delta f=\frac{1}{2\lambda_e}(C_s\lambda_e^3\frac{R^2M^2}{L^2\lambda_L^2}-n\frac{L^2\lambda_L^2}{R^2M^2})

\noindent 式中： $\lambda_e$为电子波长，$\lambda_L$

为光波波长，M为显微像的放大倍数，R为衍射环半径，L为光学衍射仪相机长度，n表征明暗环顺序，第一亮环对应于“$n=1$”, 第一暗环对应于“$n=2$”，与此类推。从Thon环中不单能获得离焦值 和反差曲线，而且还可以判断成像中的像散的大小，以及样品是否存在漂移以及漂移大小等成像的质量。在 使用相位反差成像时，要注意选择较大的（甚至不用）物镜光栏，以便使更多的散射波通过光栏，从而与透射 波干涉产生更佳的相位反差。

电子显微镜的反差是散射反差和相位反差的综合。对厚样品，使用小的物镜光栏，就形成散射反差，能够直接 观察到较大的结构。对于薄样品，使用大的物镜光栏就形成相位反差。对于微细结构（$\leq 1nm$）的成象，相位反差是主要的。尤其轻元素的小结构，相位反差几乎成为唯一的反差来源。因此，在生物大分子 的结构研究中，只有使用相位反差成像才能获得重要的结构信息。要获得高分辨的相位反差成像，除了需要合 适的样品外，还需要一台具有一个相干光源和单色性好的电子束的电子显微镜。只有这样才能在像平面上透射 波和散射波之间才具有固定的相位差，才能获得清晰的像。现代电镜为了获得相干的点光源，使用场发射电子 枪，为了提高电子束的单色性，采用电子能量过滤等设备，因而，获得高分辨的相位反差像。

电子衍射

1927年晶体对电子的衍射实验证明了电子的波动性质，同时也发展了电子衍射分析这门新兴的学科。由于电 子的波长比X射线的波长短得多，物质对电子的散射比对X射线的散射强得多，从而使电子衍射与X射线在应用 上各有不同的特点。特别是由于电子衍射能与透像成像结合，相互补充，为晶体结构研究开拓了新途径。通过 对电子衍射谱进行分析，可以获得关于样品的晶体点阵类型，点阵常数以及晶体的取向等参数；在特定的条件下 还可能性确定样品的化学成分。

Image:.jpg[htbp]

 \centering
 \includegraphics[width=12cm]{fig_crystal_diff}\\
 \caption{晶体衍射图样}\label{fig_crystal_diff}

\end{figure}

和一束光照射到一个光栅上能产生衍射的现象相似，一束电子波照射到晶体样品或其他周期结构的样品上时， 也产生衍射--称电子衍射。图\ref{fig_crystal_diff}所示是电子衍射所产生的衍射谱。如果样品是单晶（指整块晶体的结构是由一 种空间点阵贯穿和决定的）则所得的衍射谱为规则排列的斑点，如图\ref{fig_crystal_diff}（a）所示。如果样品是多晶(由许多 相同的小单晶合成的，但其相对取向完全无规则的)的得的衍射谱为一系列不同半径的同心圆环。如图\ref{fig_crystal_diff}（b） 所示。从图中可见，衍射谱中除了由透射束形成的中心亮斑外，尚有与透射束偏离一定角度的衍射束所形成的一 系列的亮斑(或亮环)。

这些衍射束与入射束的夹角必定满足于：\\

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): 2dsin\theta=n\lambda

\noindent 式中： $d$为晶面距离，$n$ 为自然数；$\theta$

为衍射束与入射束夹角的一半（称为布拉格角）；$\lambda$ 为电子波波长。\\ Image:.jpg[htbp] \begin{minipage}[t]{0.48\linewidth} \centering \includegraphics[width=0.5\textwidth]{fig_crystal_difforigin} \caption{电子衍射原理示意图}\label{fig_crystal_difforigin} \end{minipage} \hfill \begin{minipage}[t]{0.48\linewidth} \centering \includegraphics[width=0.5\textwidth]{fig_crystal_diffem} \caption{透镜选区衍射示意图}\label{fig_crystal_diffem} \end{minipage} \end{figure}

这就是布拉格定律。图\ref{fig_crystal_difforigin}是电子衍射原理图，从图中可见，从衍射点(或环)到屏中央透射斑的距离R为：

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): R=L\cdot tg2\theta

\noindent L为从样品到屏的距离。由于$\theta$角非常小，可以近似地认为：

无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert): tg2\theta\approx 2sin\theta

\noindent 那么：$R=L\cdot 2sin\theta$ ，用布拉格公式代入可得： 无法解析 (PNG conversion failed; check for correct installation of latex, dvips, gs, and convert):      R=L\cdot \lambda/d 
或$Rd=L\lambda$ \noindent    这就是电子衍射的基本公式，

$L\lambda$称为相机长度。在$L\lambda$ 确定的情况下，测出R就可以计算出对应的晶面间距$d$ 。$L\lambda$

的测定通常是利用某些标准样品（如

金，铝等)的衍射谱来测定。这些标准样品的 值已知，在衍射谱中的测量出对应的R，就可以计算出$L\lambda$。

在电镜中实际情况如图\ref{fig_crystal_diffem}的示。一束平行电子束射到晶体样品上，除透射束外，按布拉格定律 形成一系列衍射束。这些电子束都是平行束，受物镜的会聚作用而分别会聚在物镜后焦面上的0，-1，1 等上，形成衍射谱。若在物镜后焦点上放一屏，就可以看到衍射谱。根据惠更斯原理，这些衍射谱0，-1，1等 可看作次级光源。它发出的次级波是相干波，在物镜的像平面干涉形成一级放大像。如图\ref{fig_crystal_diffem}中的 $I_1$，$I_1'$，$II_2$，$II_2'$等就是$O_1$，$O_1'$，$O_2$及$O_2'$的像。由此可见，电镜很容易把成像和衍射结合起来。 实际上透镜的成像可以分为两个过程：电子束受晶体的衍射作用分成若干不连续的衍射束，经过物镜在 后焦面会聚成衍射谱--即由物变成衍射谱的过程；衍射谱发出的次级波在像平面相互干涉形成了像--即 由衍射谱重新变换成物（像是放大了的物）的过程。从数学上来说，成像过程是由两次连续的傅里叶变换 组成。上述的前过程是第一次傅里叶变换--物的透射函数的傅里叶变换：后过程是第二次傅里叶变换--衍 射谱的傅里叶变换。

如果希望研究某个微小区域的样品的衍射谱（如果样品并非单一晶体时是必要的），就需要把该区域以 外的样品遮挡掉--这种称为选区衍射。最简单的方法是在样品上放置一个光拦，挡掉该区域以外的入射 电子，但这样做往往是困难的。因为选区通常很小，光拦制作困难，也不易准确放置在所需的位置上； 另外过小的光拦孔极易被污染至不能使用。目前电镜中一般把视场限制光拦入在物镜的像平面处， 由于像是经物镜放大（常为100~200倍），这样光拦孔也要以放大100~200倍，较好解决上述的困难。

对于生物大分子晶体样品，其晶面距离$d$ 往往较大，而衍射斑点到中心距离$R\propto 1/d$ ，这样衍射谱中斑点的R都很小，这将影响R的测量准确性，并且受到透 射束的中心亮斑的光晕的影响，有时甚至连衍射点也看不到。因此要设法增大R，由于$Rd=L\lambda$ 中$\lambda$是固定的，要增大R就要增大L，使衍射点分散一些。方法很简单，只要关掉物镜和中间镜就可以达到， 这称高分散衍射（或称小角度衍）。目前电子衍射已经常使用于生物大分子的结构分析中。

样品制备

电子晶体学方法对样品的要求

电子晶体学方法的蛋白质晶体样品，最好是含有的$10^3$个以上单胞的二维周期排列的晶体，其厚度 应为一层厚的单胞。对于多单胞层的晶体，由于含有不同取向的重叠分子，密度图解释起来有困难。 一般来说样品厚度小于20nm时，弱相位体近似仍然有效的。如果单胞个数太少，在电子衍射时就得不到 高分辨的衍射斑，因此，所含单胞数要尽可能多。蛋白质悬液的浓度可以从$10\mu g/ml$到$10mg/ml$之间,但一 般为$1\sim 2mg/ml$。浓度过低影响数据的收集效率。浓度过高又会引起样品重叠。每一具体蛋白晶体样品浓度需 要尝试才能确定。蛋白质悬液中盐的浓度，从成像角度来看越低越好，但蛋白质晶体需要一定浓度的盐和其 他化学物质才能稳定。因此宜在确保蛋白质晶体稳定的前提下，使盐浓度降低。

结晶是对于一个达到平衡状态的系统的化学过程。在这个过程中，蛋白质分子按有序排列而集结。在x射线晶 体学中所提到的获得过饱和蛋白质溶液的实验方法，在原则上也适合于产生薄晶。各种蛋白质结晶的实验条 件是不尽相同的，通常结晶条件的变量是pH值，温度、蛋白质浓度和沉淀剂等。目前，对于水溶性蛋白，最 常用的是在脂单层膜上实现蛋白质的有序二维组装。对于膜蛋最常用的方法是将蛋白重组到脂双层中实现二 维结晶。关于蛋白质结晶的问题本书将不详述。

碳微筛膜的制备

所有的电镜样品均需要用带有支持膜的铜网支持。但各种技术对对支持膜要求有所不同。 生物大分子样品需要碳微筛(有许多小圆孔的碳膜)。因为研究生物大分子结构要求分辨率较高，因 而要求支持膜较稳定，观察时样品不会产生漂移。碳膜能满足这个要求，而且碳膜产生的噪音较低。 使用微筛膜，一方面是因为微筛小孔的边缘利于聚焦。更重要的是微筛膜的小孔可以形成薄的水膜， 冷冻形成玻璃态的冰后，用作支持和保护生物大分子样品。不同样品对微筛孔大小要求不同。但碳微 筛膜必须具有亲水性，以使大分子样品能够均匀分布，不会造成重叠。刚制备的碳微筛膜具有亲水性， 经过一段时间后就会变成疏水性。这时就需要进行亲水性处理。较好的办法是离子溅射亲水性处理，简 单可行。碳微筛膜质量对制样和成像的影响很大，应该尽 力获得高质量的碳微筛膜。高质量的微筛膜应具有：

• 碳膜厚度均匀适中,大约在10nm左右。*小孔直径大小相近，约$1\mu

m$左右（不同研究对象有所不同）。 *小孔为圆形或接近圆形。

碳微筛膜的制备方法是建立在第三章介绍的支持膜制备方法的基础上。具体制备方法如下：

• 如第三章所述，准备好干净的铜网和玻片。配制好$0.2\sim 0.3\%$Formvar氯仿溶液。
• 将50滴$50\%$的甘油加入50mlFormvar氯仿溶液中，用超声波振荡器强烈振荡几分钟。
• 把干净玻片浸入其中静置片刻，然后取出垂直放在滤纸上，使其凉干。
• 用刀片沿玻片边缘划一刻痕后，将其慢慢斜插入培养皿的双蒸水中，使膜漂浮于水面上。
• 将干净的铜网排列于膜上，用一稍大于膜的滤纸覆盖在膜上，待滤纸湿后，用镊子夹住纸的一端，

一边轻轻提引，一边翻过来，把滤纸及铜网从水面上取下来。凉干，待用。 * 把铜网置于甲醇溶液浸泡约30分钟，溶去甘油。凉干即为粘有Formvar微筛膜的铜网。

• 把铜网置于真空喷涂台上，在高真空中喷上约10nm厚的碳膜。然后置于氯仿溶液中浸泡，

大约1小时左右可把Formvar膜除去。待凉干后即为碳微筛膜。

关键步骤的如图\ref{fig-Cryo-Holyfilm-Preparation}所示。 Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=6cm]{fig-Cryo-Holyfilm-Preparation} \caption{微筛网的制备过程(引自from M. A. Hayat and S. E. Miller (1990))} \label{fig-Cryo-Holyfilm-Preparation} \end{figure}

微筛膜孔的大小取决于甘油滴的大小。如孔过大则延长超声波振荡的时间和增大振荡强度。 若孔太小则反之。碳微筛膜的制备方法有多种，这是其中较常用的方法。

制样

蛋白质电子晶体学方法对制样的最重要的要求是获得在真空中，水份不会汽化，蛋白晶体保持原 样不会发生变化的样品。基本方法有二： I、糖包埋法：使用糖，如葡萄糖，丹宁酸等取代蛋白质中的 水份。糖是非挥发性物质，覆盖在蛋白质晶体上的一层糖分子能阻止蛋白质分子在电镜的高真空中因 水分汽化而引起结构变化。而且糖与水在化学和物理学性质相似，蛋白晶体中的水份被糖取代后，其结 构经X射线衍射分析并未发现有变化，从而达到防止真空损伤的目的。这种方法简单，而且其表面张力 会使蛋白质薄晶展平。其缺点是糖的密度与蛋白质非常接近，因此成像的反差很弱。但对于电子晶体学 来说，振幅数据来自电子衍射，因此对结果影响不太大，仍然是可用的。

糖包埋的制样方法很简单，用1~2％葡萄糖或其他糖类溶液与等量的蛋白质晶体悬液混合，取$5\mu L$ 混合液滴在新制得的微栅碳膜（此时微栅碳膜是亲水的，如果不是新制得的栅碳膜是疏水性的， 用辉光放电溅射可获得亲水性）上，稍等一会用滤纸吸去多余的是液，待干即可上电镜。

II、非晶包埋法：用$5\mu L$的蛋白悬液滴在带有亲水性处理过的微栅碳膜的铜网上，稍候用滤纸吸去多余的悬液， 立刻投入液氮冷却的乙烷中急冷。在低温（-170℃）下在乙烷中或液氮中放入冷冻样品传输装 置中，再放入电镜中，在在低温下进行电镜观察。

非晶态包埋法是目前最好的方法。它能很好保护样品免受真空损伤。其次能提高生物样品抗 辐射损伤的能力，一般能提高一个数量级（蛋白质晶体样品可以允许电子剂量达$10e/\AA^2$）。其三 是冰与蛋白晶体的密度差大于糖与蛋白晶体的密度差，因而反差较好。此外，由于被瞬间冷冻 固定因而能基本保持样品在自然状态的结构，还具有允许进行动态的研究等优点。因此，是目前 普遍使用的方法。但也存在一些缺点，主要是对设备要求高，技术难度大，体现在： ①样品冷冻 速率必须达$10^5\,^\circ \mathrm{C}/s$(摄氏度每秒)，在这样的冷冻速率下，样品中的水份来不及结晶，从而形成非晶态的冰， 不会损伤样品。否则冷冻速率较慢就会形成晶态的冰，就会损伤样品。 ②冰包埋的样品，冰膜的厚 度要适合，太厚对成像产生干扰，甚至无法成像，太薄则不能保护蛋白样品，甚至无法成膜。获得 厚度合适的样品并非容易的事。它取决于室温、温度、碳膜的表面性质，生物颗粒的吸附性能以及 滤纸的吸干的速率和吸干所用的时间。因此需要反复的试验，从而取得经验才能有较高的成功率。

低剂量高分辨衍射和成象=

在原理上，从显微像的傅里叶变换可以的获得Fourier函数的振幅和相位。然而由于电镜的象差和 不稳定性，从像中获得的Fourier函数的振幅被包络函数所调制。因此，所得的数据要进行解调。 但是蛋白晶体对辐射损伤非常敏感，在这样的条件下进行解调是十分困难的。替代的办法是测定同 一区域的电子衍射谱的反射强度，用这些数据去计算Fourier函数的振幅。因此，要获得蛋白质晶体 的二维结构信息，起码要拍摄四张照片：

• 低剂量的电子衍射谱。它提供的信息通过傅里叶分析获

得Fourier函数的振幅。由于电子衍射所需要的电子剂量很小，所以首先拍摄电子衍射谱，可以避免 辐射损伤。

• 低剂量的电子显微像，它提供的信息通过傅里叶分析获得Fourier函数的相位。
• 第二张低剂量显微像完全相同的区域和完全相同的成像条件，只是电子剂量增加的高剂量显微像。这张

显微像提供的信息可以计算出低剂量显微像的离焦量 和相位反差传递函数。虽然对低剂量显微像进行傅里叶变换，从原理上也应可以计算出离焦量 和反差传输函数来，但实际上由于低剂量显微像的反差太弱。从一张像中难以获得。而且此时样 品的结构信息已从第1和第2张照片中获得，无需要继续保护样品不受辐射损伤了。因此拍摄高剂 量像、由于反差强一张照片即可解决问题。

• 高剂量低倍显微像，用以估计蛋白薄晶的厚度。

需要特别指出：在第三张显微镜拍摄之前，无论是低剂量的衍射或低剂量的成像以及之前寻找样品，聚 焦调节过程中，都不能有高剂量的电子束照射到样品上，要严防样品的辐射损伤。具体方法因仪器不 同和不同的研究者而不同。此处不作详细介绍。拍摄低剂量的显微像，一般采用3-6万倍之间。原因 一方面是对有限的曝光剂量，要保证照相底片达到一定的里度。另方面保证照片内有足够的蛋白质晶 体单胞数目。此外拍摄使用高灵敏度的底片，如Kodak ISO-163底片。

为了获得三维结构，必须拍摄一系列样品倾斜角的高分辨显微像。由于样品的倾斜，样品中各区 域的聚焦不同，形成聚焦梯度。在图像处理时需要进行较正。

计算机图像处理和重构

蛋白质电子晶体学的计算机图像处理和重构成主要应用的数学工具是傅里叶变换和卷积。 傅里叶变换是把实空间的信号转换到频率空间（即是空间变量由x、y，z变成为频率变量 $\rho_x,\rho_y,\rho_z$）。它是一个可逆的线性操作。在频率空间信号是复函数，因此可以表达为振幅和相位。 卷积是一种乘法性质的操作。经常使用的卷积定理是：两个函数的卷积的傅里叶变换等于 它们各自傅里叶变换的乘积。

计算机图像处理主要内容是：

• \textbf{图象数字化：}

根据采样定理，为了防止不同频率的信息在傅里叶空间发生重叠效应，采样频率应大于图 象最高频的两倍，或者说采样的步长应小于分辨率的$1/2$。例如要求的分辨率为lnm，则采样步 长应小于0.5nm。但实际上在处理过程的一些缺陷，结 果分辨率不是步长2倍，而是大于2倍。因此，最好的采样频率是分辨率的三倍。

• \textbf{实空间的图像处理：}

普通的图像总是在某些亮度范围内频率高，而在另一此范围内低，从 而不能有效地利用显示器的灰度级。使用直方图均等化技术展开峰值区的显示灰度级，压缩低 谷区的灰度级。从而改善图像的灰度级。此外，还可用边缘增强技术增强图像中的特征细节。

• \textbf{滤波、去噪：}

对于周期性的二维晶体图像，对图像进行傅里叶变换获得一个衍射谱，衍射点包含了图像的信息 ，而其背景则是噪音所致。于是保存衍射点而去掉背景。把这个衍射谱进行反傅里叶变换，则 获得去除噪音的图像。对于电子衍射谱的处理主要是除去非弹性散射的是径向分布的背景。

• \textbf{解调：}

由于显微像被相位传递函数所调制，因此须解调。在测得传递函数后进行解调。

• \textbf{二维结构的重构：} 从电子显微图像和电子衍射谱通过傅里叶变换取得结构

因子的相位和振幅。对提取出的结构因子进行傅里叶合成，从而获蛋白晶体的二维重构像。

• \textbf{三维重构：}

三维重构是建立在中央截面定律的基础上的。中央截面定律指出：三维物体沿Z轴的二维投影 的二维傅里叶变换与 该物体的三维傅里叶变换 在Z 轴方向的中心截面 等价。这样就可通过傅里叶变换把三维结构与其二维投影之间的关系建立起来。电子显微图 像就是样品的二维投影。当有足够多的系列倾斜角的显微像，通过傅里叶变换，就获得样品 三维傅里叶变换在各个方向的中央截面。通过傅里叶合成就获得样品的三维结构。

蛋白电子晶体学方法是大分子电子显微学中最早出现的技术，也是目前唯一分辨率能达到原子分辨 率的电镜方法，完成了一批水溶性蛋白的三维结构测定，分辨率达0.3-0.4nm。还有一大批分辨率达 1-2nm的蛋白晶体结构被测定。但其分辨率还是与X射线晶体学所得的分辨率有较大的差距。后 来发现一些膜蛋白能在自然的膜环境中以二维晶体的形式存在，如细胞视紫红质等。还有另一 些膜蛋白较容易在脂双层中实现二维结晶，而膜蛋白由于自身具有部分亲水性，部分疏水性的 结构，使三维结晶十分困难,造成应用X射线晶体学很难涉足膜蛋白的结构分析。因而把膜蛋白的结 构分析寄望于电子晶体学方法，而且电子晶体学也确实完成了几个膜蛋白的结构测定，分辨率达 原子水平。例如，细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)、植物捕光能复合体II（plant 1ight-harvesting II）、水通道(aguaporin)以及乙酰胆碱受体(acetycholine receptor)等。但是至今，膜蛋白二维结晶仍然是非常困难的。相反膜蛋白三维结晶的技术日益成熟， X射线晶体学测定了许多膜蛋白的结构。因而目前看来，电子晶体学无法与X射线晶体学竞争，只能是x 射线晶体学的一种辅助手段。但它有一个无法取代的优势：能得到膜蛋白和膜相关的水溶性蛋白在膜环 境中的结构信息。比X射线晶学所得到的更能反映生理条件下的真实结构。 %LHC2