目录 1 概述 1.1 电镜细胞化学的种类 1.2 电镜细胞化学技术的关键 2 电镜细胞化学的一般步骤 2.1 取材 2.2 固定 2.3 厚切片 2.4 孵育 2.5 孵育后处理 2.6 对照实验 3 冷冻电镜细胞化学技术 4 电镜酶细胞化学技术 4.1 电镜酶细胞化学的基本原理 4.2 电镜酶细胞化学的种类 4.3 乙酰胆碱酯酶 4.4 葡萄糖－6－磷酸酶（G－6－P酶） 4.5 5'－核苷酸酶（5'－N酶） 4.6 三磷酸腺苷酶（ATPase） 4.7 腺苷酸环化酶 4.8 过氧化物酶 4.9 琥珀酸脱氢酶（SDH） 4.10 细胞色素氧化酶 4.11 过氧化氢酶 4.12 胆碱乙酰转移酶 5 糖类的电镜细胞化学 5.1 多糖的电镜细胞化学 5.2 复合糖类的透析铁染色法电镜细胞化学 5.3 复合糖类的高铁二胺染色电镜细胞化学 6 脂类的电镜组织化学 7 DNA的电镜组织化学 7.1 利用PTA方法对染色质染色 7.2 DNA的锇－氨络合物染色

概述

电子显微镜细胞化学（Electron Microscopy Cytochemistry，简称：电镜细胞化学），是光学显微镜组织化学、细胞化学基础上的延伸与发展，实际 上也就是普通细胞化学技术在电镜水平上的发展和应用。电镜细胞化学主要用于研究细胞内各种成分在 细胞超微结构水平的分布状态，以及这些成分在细胞中的定性、定量及代谢变化情况，目的是阐明各种细胞 成分在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系。

电镜细胞化学与光学显微镜组织、细胞化学的根本区别在于：光学显微镜细胞化学是利用特定的化学显 色反应，将要研究的细胞成分以显色的方式在细胞原位凸现出来；而电镜细胞化学则利用特定的化学反应， 形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位，借助电子显微镜进行超微结构的原位分析。 目前，常规的超薄切片技术已经比较成熟，非常容易观察到细胞内各种细微结构，当要用这种方法得知细胞内 各种成分及其在细胞活动中的变化还无能为力。用生化分析的方法可以测得细胞中各种组分的准确含 量，当这种方法只有破坏细胞结构，把组织匀浆后才能实现，这对了解完整细胞中酶的分布和变化是不 合适的。利用电镜细胞化学技术研究细胞的结构与功能，无需对所要研究的成分进行提取和分离就能获得组织 和细胞内该成分的定位、代谢等大量信息。对分子生物学或生物化学的研究来说，电镜细胞化学既可先行指路， 又可相互佐证，它可将分子生物学、生物化学和超微结构研究等多方面有机地联系起来，在尽量保持细胞内固 有结构的基础上显示分子生物学研究对象及其生化反应在细胞器、膜系统、大分子复合体等上的情况。这样也就 将超微结构和机能反应紧密地结合起来。

电镜细胞化学的种类

电镜细胞化学技术种类繁多，包括：酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、电子显微镜放射自显影技术、离子 细胞化学技术、示踪细胞化学技术及电子显微镜特殊染色技术等。根据细胞化学反应的原理，这些技术可 以分为以下几类：

用特异的处理方法使组织和细胞上的电子透明物质产生电子致密沉淀物的方法。这种方法包括：

依赖化学键作用力产生金属盐沉淀，从而进行电镜下观测研究的方法。这种方法又被称为离子细胞化学技术。

被检测物质作用于适当的底物而形成可见的电子致密的沉淀物。许多酶的电镜细胞化学都是属于此类。

标记的抗原抗体复合物：组织和细胞内的抗原可借助电子密度高的标记物如铁、金等，从而得 到显示。免疫电镜技术、免疫细胞化学技术等都属此类。

• 特异酶消化或特异溶剂提取法使原本存在的电子致密物质消失的鉴别方法。

某些细胞器本身，本来具有电子密度较高或经常规染色能形成电子密度较高的结构，用特异的酶或特定的溶剂 在组织固定或前处理时，预先进行反应，使其在以后的固定和染色过程中不产生电子密度较高的结构，以反 证其存在。例如：在组织、细胞固定前，预先用RNA酶，DNA酶消化，然后再用特异染色，电镜下在相应的部位 出现空白区域，以反证核酸的存在。如要鉴别脂肪可用有机溶剂进行处理。 * 被检测物本身是自然的电子密度较高的元素或化合物。常见的天然电子密度高的物质有铁蛋白、血红蛋白等。

电镜细胞化学技术的关键

电镜细胞化学方法的关键在于找到能与组织和细胞内物质进行特异反应的试剂，这种 特异的反应及其试剂应满足以下要求：

• 反应试剂与组织或细胞内被检测物质发生的反应必须具有特异性； *

反应不损伤或破坏组织或细胞本身的超微结构；

• 反应的最终产物为电镜能观察的电子致密物，一般为微细的、颜色很深的沉淀物，而且在

所研究物质的原位沉淀，在所有的制样和观察过程中不会改变位置； * 反应具有可重复性。

由于电镜的分辨率比光学显微镜要高得多，反应最终产物的任何微细变化在光学 显微镜观察时不易发现，但在超微结构上的变化就非常明显。因此，对电镜标本的制 备方法也有一些特别严格的要求，每个步骤都要十分精心的操作和控制，以避免在超微结构水平上出现假象。

电镜细胞化学的一般步骤

传统的光镜组织化学方法须经固定、脱水、石蜡包埋、切片等一系列步骤后才能进行孵育， 这样对酶等物质的活性损伤较大。为了保存活性，减少所研究物质的流失，目前光镜组织化学 采用的方法是：将组织块固定后直接用冰冻切片机或组化切片机切成薄片，接着进行孵育，不经 过包埋等步骤。这样处理使酶等的定位明显改善，所研究物质的活性检出率液显著提高。电镜细 胞化学技术是在后一种方法基础上改进的，孵育前的步骤大致与光镜组织化学方法相同。但孵育 后，还需经后固定、脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤。电镜细胞化学与纯形态学方法颇为相似， 不同点在于前、后固定间加入了厚切片和孵育等步骤。一般来说，电镜细胞化学技术包括以下几个步骤。

取材

取材的方法和要求基本与形态学相同。在电镜细胞化学技术中，用灌注固定后再取材的方 法，对保存酶等物质的活性及定位较为理想。

固定

由于组织和细胞内的化学物质，如酶等，都是十分敏感的物质，在样品制备期间容易丢 失、扩散或失去活性，因而必须采用适当的方法将它们的位置和活性进行固定。固定的作用， 除立即杀死细胞并把它的超微结构真实地保存下来外，还有另外一些作用，如改变细胞膜的通 透性，促进孵育液种的各种成分顺利进入细胞内部，与所研究的物质成分发生化学反应，从而使 该成分保存在原来的位置而不扩散或被洗去等。可见，固定的好坏将直接影响到细胞超微结构的 保存和细胞内化学成分的定位等。

但在制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾。若向保存好结构，则需 充分固定，但固定越彻底，酶等物质失活越严重。就理论上讲，细胞化学保存酶活性最好的方法是 不经固定的新鲜组织。可将新鲜组织先孵育后再做固定，必然导致出现反应产物不均匀、扩散、吸 附、流失等现象。这就导致"错误定位"等假象。严格地说，在制样过程中酶等物质的流失和活性的 损失是不可避免的，但应尽量减少这种损失。应用于电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足以下 条件：

结构保存： 不清晰的结构不仅难于鉴别正常与异常，而且给细胞化学反应产物的定位带来困难。 因此，要求组织块要新鲜，固定及时。 机能保存： 除了保存良好的结构外，还需保存研究物质的活性。有些物质，如酶等，在常规的固定、脱水等 步骤中，其活性容易受到破坏，因此适当的固定方法和固定剂的选择很重要。 * 定位保存： 细胞化学的最终反应在细胞特定的区域内以不溶性的颗粒沉淀定位。有些细胞内成分使用常规固定 方法后，在脱水、包埋等操作中容易扩散和流失，造成假象。良好的固定应避免这些物质的扩散。

化学固定方法仍广泛应用于电镜细胞化学技术中。 电镜细胞化学技术中使用化学固定方法时，固定试剂的种类、缓冲液种类和条件、固定的时间和固 定方式等方面都将严重影响最后的结果。

普通超薄切片技术常使用戊二醛-锇酸双固定的方法，这两种固定剂配合使用可较好地保存细胞的 超微结构。但有些物质如一些酶，用戊二醛和锇酸固定时能破坏它们的活性。如用锇酸固定大鼠肝 组织时可保存清晰的细胞结构，但酸性磷酸酶的活性仅能保持1－2％。最早用于电镜细胞化学的固 定剂如：高锰酸钾、甲醛等能较好地保存某些诸如酶等物质的活性，但它们又不能良好的保存细胞 的超微结构。如甲醛、多聚甲醛固定能较好的保存酶的活性，但保存细胞超微结构的完整性却较差。 因此，选择电镜细胞化学的固定剂时经常面临很大的矛盾。现在用于电镜细胞化学技术的固定剂常 用多聚甲醛和戊二醛的混合液进行固定。如0.5%～2%戊二醛加2%～4%多聚甲醛。其实，有时单用多 聚甲醛也可以，在细胞超微结构保存方面并无多大问题，关键是取材后的标本应迅速得到固定。作为 固定剂的醛类溶液必须很纯，否则会影响实验结果，一般要求1％的戊二醛水溶液在紫外分光光度计 上测得的235nm与280nm的吸收比（A₂₃₅/A₂₈₀）在0.2以下，pH值大于4。否则应对戊二醛进行提纯处 理。

用于电镜细胞化学技术的缓冲液种类很多，常用的有醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲 胂酸钠缓冲液。通常用缓冲液配制固定液、漂洗液和孵育液。固定液和漂洗液的pH值要求7.2～7.4， 而孵育液的pH则随所研究的物质的不同而变化较大。电镜细胞化学对缓冲液的成分要求较高，选用缓 冲液时，应根据所研究的物质来决定。如研究的成分或孵育液中含钙，则一般不用磷酸缓冲液，因其常 常和孵育液中的成分产生沉淀，此时应选用二甲胂酸钠缓冲液时，要注意胂酸盐有毒。又如钠离子 对K^+依赖性磷酸酶有抑制作用，因此，所有液体都应除去钠离子。Tris属于氨基的缓冲液，由于 氨基和醛基能发生化学反应，所以二类试剂不能在一起使用。

有时需要在固定液中加入蔗糖或葡萄糖（或聚乙烯吡啶烷酮，即PVP）等调节固定液的渗透压。 在实际应用中，常常使用略高于体液的渗透压，以减少研究物质的扩散，但高渗溶液容易造成细 胞收缩，因此必须控制好浓度。此外，在电镜酶细胞化学中，有时为了保护酶的活性和提高酶对固 定剂的耐受性，有时还会在固定液或缓冲液中加入少量的底物（1～2mmol/L）。例如，当测定G－6－P酶 时，通常在戊二醛固定液中加入1～2mmol/L的葡萄糖－6－磷酸底物。但要注意，若添加的底物的量若不 合适会导致反应产物的非特异性扩散，影响最后结果。在某些情况下，可在固定液或缓冲液中加入 少量的赋活剂以保护酶等的活性。如非特异性碱性磷酸酶，在缓冲液中加入少量的镁，可获得更好 的效果。但在实际应用中，一般很少添加底物和赋活剂。

对于电镜细胞化学技术来说，固定的时间应以尽可能少地减弱研究物质如酶的活性同时又尽可能 多地保存超微结构为原则。有些对固定剂很敏感的物质更应尽可能采用短时间的固定。如： 葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PDH）仅能固定2分钟。游离细胞可直接加到固定剂或离心后加 入固定剂；实性组织通常需切成小块后再放到固定剂中。一般来说用灌流的方式能更好地固定 样品，但固定时间不宜过长。灌注固定的固定效果应明显优于浸泡固定，即将样品直接取材， 切割成合适大小的样品块后，将样品块浸泡于固定液中。然而，灌注固定远不如浸泡固定那样 应用广泛，其原因有两方面：一是使用范围受到一定限制，如人体组织的固定（活检）、植物 材料以及各种培养细胞等；二是这种方法需要比较高的技术，一般不易掌握。而对于浸泡固定 来说，样品块的体积也是应该特别注意的。研究表明，人肝在室温和冷溶液中用4％的戊二醛固 定24小时，其渗透深度分别为4.5毫米和2.5毫米。因此，为了能迅速对细胞内各组分及时进行固 定，一般用于电镜细胞化学研究的样品块体积应小于0.5立方毫米。对于植物材料及一些具有致 密结构的材料，组织块体积更应小些。

固定后，样品需充分漂洗，漂洗不干净往往会影响后面的反应。

厚切片

最早用于电镜细胞化学的样品常将组织块直接进行孵育，但因组织块太厚，一般孵育液 只能渗透组织表面40μm左右，因此在固定漂洗后，常需将组织块在组织切片机上进行切片， 制备成40μm左右厚的切片。分离的细胞器、培养的细胞等不需进行厚切片。冷冻固定的组织用 冷冻切片机切片

孵育

让组织和细胞与某种试剂在特定的条件下充分作用的过程叫孵育。细胞化学反应在孵育中 进行。孵育是电镜细胞化学技术的关键步骤。因而对孵育液的成分、选择合适的底物、良好的 缓冲系统、最佳的pH、适当的温度以及孵育时间等都必须加以充分的考虑。

• 孵育液各种成分的要求：各种孵育液的成分比例都有严格的范围，不能随便变更，

以免扰乱溶液浓度；所使用的各种化学试剂都必须保证质量，起码应是分析纯（AR）级， 特别是底物的要求更为严格；底物试剂最好放置于干燥器内，并置低温保存；对吸水的 化学试剂和药品必须密封，并保存于干燥器内。

• 孵育液的配制：多数孵育液必须使用前新鲜配制，按配方顺序逐一加入各种试剂并随时

不停搅拌（最好使用搅拌器），特别是电镜酶细胞化学更应在用前现配；所使用的器皿要特别 干净，避免使用、接触金属；加入含铅试剂等时，需缓慢滴加，同时不停搅拌，否则反应速率 和效果都将不好；孵育液配制完毕后最好再次调整pH。

• 孵育时间和温度：虽然在0～4℃下孵育有利于保存超微结构，防止反应物的扩散，但有

的物质如酶在此温度下无活性。因此一般孵育温度为37℃，主要根据细胞化学反应要求而定。 孵育时间可因组织、细胞和所研究的物质种类而差异很大。如大鼠肝脏的Ca^{2 +} －ATPase要 求37℃30分钟即可，而显示ACP则需25分钟，心肌SDH仅需10分钟即可。总之，孵育时间最短， 又能达到满意的反应结果为最好。若孵育时间过长，则易引起反应产物的弥散而产生假象； 为了把握好孵育时间和效果，最好在孵育过程中不同时间取出部分切片进行检查，以确定孵育时间。

孵育的方法，对于冷冻切片来说可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育，一般 的厚切片可直接放到孵育液中进行孵育。

• 在孵育时，常要根据拟测定的物质设置对照实验。

孵育后处理

一般在孵育后仍要用1％的锇酸进行30～60分钟的后固定，也有人在孵育完成后再用亚铁氰化钾还 原锇酸代替锇酸作后固定，以提高最后结果的反差。后固定后一般可按常规处理。由于组织较薄， 后固定、脱水、渗透与包埋时间可缩短。另外必须注意超薄切片染色时，有时可能会模糊细胞化学反应的细 节。

对照实验

对照实验是任何细胞化学常规实验的重要组成部分。电镜细胞化学除扩散、吸附等原因可造成 假象外，有时不可避免地出现伴随反应。如，进行葡萄糖－6－磷酸酶反应时，由于葡萄糖－6－磷酸 盐作为底物，而这底物常可和碱性磷酸酶、ATP酶等磷酸酶系列发生反应，从而造成假象。因此，使用 电镜细胞化学反应方法进行研究时必须进行对照实验。

冷冻电镜细胞化学技术

前面已谈到由于组织和细胞内的化学物质，在样品制备期间容易丢失、扩散或失去活性。常规的制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾。所以，用于电镜细胞化学标本的较好的固定方法当属快速冷冻固定方法。

快速冷冻样品可在极短的时间内，将样品迅速冷却至液氮温度。这种方法可以将样品的自然生活状态尽快地保存下来，同时又极大地保存了所要研究物质的活性。基本满足了前面讲到的电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足的条件，较好地做到了结构保存、机能保存和定位保存，很好地解决了常规样品制备过程中遇到的矛盾。 冷冻电镜细胞化学技术的具体步骤与常规的基本一致，也需要取材，固定，厚切片，孵育以及孵育后处理等步骤。

样品快速冷冻固定的方法有多种，详细技术见第七章。冷冻固定后的组织用冷冻切片机进行厚切片和超薄切片。对于冷冻切片来说，可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育，也可应用冷冻超薄切片方法进行冷冻超薄切片，而后进行孵育、染色等步骤，这样不影响组织成分，但技术要求复杂。现很常用的是用快速冷冻的方法进行样品的快速固定，而后用冷冻置换的方法在常温下进行厚切片以及其它的步骤。 随着样品快速冷冻装置的不断改善，用于细胞、组织标本的快速冷冻设备已日益完善，冷冻电镜细胞化学技术的应用也越来越广泛，这对于电镜细胞化学技术的发展，无疑具有很重要的作用。

电镜酶细胞化学技术

电镜细胞化学方法有很多，但最常用的是电镜酶细胞化学和免疫电镜方法。本章将重点介绍电镜酶 细胞化学技术，免疫电镜技术将在第九章中介绍。

通常使用显微镜能正确描述生物细胞的形态结构，但不能直接证实酶等生物大分子的功能，而只能从 结构推测功能；生物化学则从功能方面推测结构。然而细胞内部的大分子物质，用常规的方法 都很难获得其形态上的结构特征，所以细胞内的酶等大分子的鉴定，常需依赖于将显微学和生物化学结 合起来的技术--酶细胞化学技术。酶组织细胞化学是20世纪20年代出现的，40年代后迅速发展起来的一 门学科。它是用组织化学的方法来证明酶的存在的方法。20世纪60年代后电镜应用到酶细胞化学的研究， 形成了电镜酶细胞化学技术。

每一种细胞都有特定的酶，而每一种类的酶常存在于细胞的特定部位，细胞内酶的定位因酶的种类而异，每 种酶都有自己固定的位置，完成其特定的生物功能。酶本身用常规的方法是不可直接观察到的，利用酶的特 异组织细胞化学反应可将酶的位置等显示出来。酶的特异组织化学反应指酶具有只作用于该酶底物的反应 （也有两种或两种以上的酶具有同种底物的情况）。利用酶的这种特性，在一定条件下，使细胞内的酶作 用于酶的底物，将底物分解产物作为反应物质，在作用部位进行捕捉，形成可在电镜中进行观察的电子致 密物，从而间接证明酶的定位。这种酶促反应被称为酶组织细胞化学反应。酶组织细胞化学反应越特异， 对该酶在细胞内的定位也就越精确。

酶的种类很多，目前已知有1000多种，其中能用光学显微镜组织化学方法显示出来的大约只有100多种。 由于光学显微镜分辨率低，放大倍数小，定位不精确。电镜酶细胞化学技术虽然发展较快，但由于该 技术对样品制备要求较高，影响因素很多，同时又不能象光学显微镜组织化学那样看到颜色效果，因此 到目前为止，能通过电子显微镜显示出来的酶还不是太多，其数量大约不到100种，而且多为水解酶和氧 化还原酶类。其它酶类的电镜细胞化学技术也有一些报道，但数量不多，技术也不够稳定，特别是重现性 较差。

尽管有着这些不足，电镜酶细胞化学技术对研究细胞生理功能和病理过程仍有着重要意义，而且由于很多酶 可作为细胞器或某些结构的标志酶，这种技术可为进一步研究细胞器的结构和功能及一些临床病理诊断提供 有利的条件，因而电镜酶细胞化学技术仍在相关领域发挥着不可替代的重要作用。

电镜酶细胞化学的基本原理

酶是一种具有生物催化作用的特殊蛋白，大量存在于有机体细胞和组织中。但它们在细胞中并 不随意分布，而往往分成一定的组群，定位在细胞内特定的结构中。例如线粒体内有生物氧化 所需的各种酶等。这些酶与非生物催化剂有明显的不同，有其自身的特点。首先它们具有高度的 专一性，一种酶只能催化一种固定的反应，并在确定的部位发生。它们的这种专一性可表现在对 立体异构体的专一性、对底物的专一性等。其次是催化的高效性，也就是酶能大大地加速反应的 速率。与相应的非生物催化剂相比，酶催化的反应速率要高好几个数量级（107～109倍）。

酶分子中存在某些特殊的活性部位，这些部位结构的保存对酶分子发挥作用起着重要的作用。酶的催化 能力受到温度、pH、金属离子和其它化合物存在的影响。酶的催化能力常因某些物质的存在而升高，这 就是酶催化的激活现象。可以激活酶催化作用的金属离子有许多， 如Co^{2 +} ,Mn^{2 +} ,Mg^{2 +} ,Zn^{2 +} ,K ⁺ ,Na ⁺ ,Fe^{2 +} 等。因此，在电镜细胞化学过程中都应注意这些离子 的存在条件。

酶的活性也可由于加入某些物质而降低，甚至完全消失，这就是酶的抑制作用。酶的抑制作用可分为 两大类：（1）竞争性抑制，加入某些空间结构和底物分子类似的物质，让它占据酶的活性部位，使 酶分子不能与底物结合，这种抑制是可逆的；（2）非竞争性抑制，这种抑制是不可逆的。抑制剂一旦 与酶分子结合，就能使酶永远失去活性。抑制酶的活性还可通过其它激活剂等来实现。

电镜酶细胞化学技术正是利用酶的上述这些性质，通过电子显微镜、超薄切片技术等确定各种酶在细 胞内的分布及其在细胞活动中的变化等。在设计电镜酶细胞化学实验时，对所研究的酶的各个性质进 行充分的了解，对整个实验的成功将是非常必要的。

酶细胞化学反应过程可分两步，首先，在一定条件下使细胞内的酶作用于底物，形成初级产物（酶反应 ），再应用化学物质（通常称为捕捉剂）与初级产物反应，形成电镜下可见的物质（捕捉反应） \ref{fig-Enzyme-Fanyingshi}：

Image:.jpg[h] \centering \includegraphics[totalheight=1.3cm]{fig-Enzyme-Fanyingshi} \caption{酶细胞化学反应过程}\label{fig-Enzyme-Fanyingshi} \end{figure}

底物

常用的底物有两种：

• 自然存在的底物：自然存在的底物能产生不溶性的电子致密物，主要应用于金属盐类以及

检查单、二及三磷酸钠，也可用于高铁氰化物还原法检查特异的脱氢酶等。

• 嗜锇性的产物。

理想的底物要求具备以下的特点：水溶性，并在水中比较稳定；能与参与反应的其它混合物"相容"， 并对作用酶没有抑制作用。

反应产物

电镜细胞化学反应应当在标本的特异部位最终出现具有高度反差的产物，因此初级反应产物经 捕捉反应后生成的最终反应产物应具有高反差性能。它们可以是金属，也可以是酶反应产生的沉淀。 理想的最终反应产物应具备以下的性能：均质、高电子密度、不被树脂和水及其它有机溶剂所溶解、 不与组织或细胞相结合，不溶于脂肪，较少生成结晶，而且不易扩散等。 * 捕捉反应// 这是电镜细胞化学中常用的反应，它的作用是使初级反应产物经捕捉反应而变成最终反应产物 以便进行电镜观察。由于捕捉反应很快，在100毫秒即可使初级反应产物与蛋白相结合，因此不 至于造成明显的扩散。

对照实验

对照实验的要求是：

• 对照实验的取材必须与实验组的材料为同一组织、同一部位的材料；
• 对照组与实验组所使用的缓冲液、孵育液（除缺乏底物外）等溶液均应一致；
• 对照组应不加底物。把组织切片孵育在缺乏底物的孵育液中，细胞不出现反应或反

应程度明显下降。如果组织存在内因性底物，即使不加底物，也会在某种程度上呈 现阳性反应。所以孵育前必须充分漂洗，尽可能使内因性底物洗净；

• 在进行酶细胞化学反应时，应进行加热或添加抑制剂等处理，使酶失活；酶抑制剂有

可逆性和非可逆性两种，可逆性酶抑制剂经漂洗、孵育后酶可重新活化。因此必须选 择非可逆性的酶抑制剂；

• 可将被测定物质用酶先进行消化、酰化或甲基化，使细胞不再起细胞化学反应。
• 可用已知阳性或阴性反应标本来检查未知标本进行对比观察。如有可能，应同时采

用多种方法检查同一种物质，以增加实验的准确性。

电镜酶细胞化学的种类

从最终产物获得的反应方法可将电镜酶细胞化学分成：金属沉淀法、锇黑法和嗜锇性多聚体生成法等几种。

金属沉淀法

此法早在1939年由美国人Gomrori和日本人Takamatsu建立，开创了光镜组织化学技术。1955年Scheldon 利用金属沉淀法第一个在电镜下证实了酸性磷酸酶（ACP酶）的存在 。%\cite{张景强-1993} 金属沉淀法的原理及生成的最终产物是金属沉淀，这种产物溶解度越低越理想。因此 常以Pb^{2 +} ，Cu^{2 +} ，Ba^{2 +} 等金属元素作为酶的捕捉剂，由它们形成最终反应产物，如：磷 酸铅、亚铁氰化铜、硫化钡等具有溶解度低、粒细、电子密度高等特点。其中 铅盐是较理想的捕捉剂，其优点是：被检出的酶种类多（各种磷酸酶、酯酶和转移酶等）； 在酸性、中性和碱性条件下均可使用；反应一次完成，不需置换反应；生成的产物颗粒小， 不易流失。但铅盐也有缺点，如反应产物有时扩散，捕捉的量过高，可能与底物相结合，对 酶活性有抑制作用，在反应液中促进底物的自然分解等。

色素法与锇黑法

光镜细胞化学反应最常用的方法是色素法，包括偶氮色素法：即用α－醋酸萘酚、 萘酚As－β－葡萄糖苷酸，β－萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物作为底物，这些底物与 酯酶、磷酸酶、糖苷酶等酶发生反应，游离出萘酚并与重氮盐相结合（偶联），以偶 氮色素沉淀于酶所在的部位。以碱性磷酸酶为例说明其反应过程如图\ref{fig-Enzyme-Oudansesufa}。 其它的色素法包括四唑盐法和二氨基联苯胺法（DAB）法。四唑盐法主要是底物中游离出来的氢原子与 四唑盐结合生成红色或蓝色的色素。这些色素法用于电镜酶细胞化学时，由于色素本身电子反差弱给 观察带来困难，因此需要在最后一步用锇酸处理，使反应产物锇化形成锇黑。这种方法叫锇黑法。形 成的锇黑反差强，图像清晰。电镜酶细胞化学常规操作中，切片经色素法孵育后用锇酸进行后固定， 此时，锇酸不仅仅起固定细胞结构的作用，还使四氧化锇还原成锇黑。因此，对色素法来说，四氧化 锇后固定本身就包含着锇黑化的过程。图\ref{fig-Enzyme-Sesufa-Eheifa}为各种色素法的锇黑法过程。

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=6cm] {fig-Enzyme-Oudansesufa} \caption{偶氮色素法}\label{fig-Enzyme-Oudansesufa} \end{figure}

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=6cm] {fig-Enzyme-Sesufa-Eheifa} \caption{各种色素法与锇黑法}\label{fig-Enzyme-Sesufa-Eheifa} \end{figure}

嗜锇性多聚体生成法

嗜锇性多聚体生成法（亚铁氰化铜－DAB－四氧化锇法）是由金属沉淀法、色素法和锇黑法几种方法相互结合而成。 这种方法利用亚铁氰化铜的氧化和DAB的氧化偶联或聚合性质检测各种水解酶、氧化还 原酶及裂解酶等。

从酶的性质来讲，电镜酶细胞化学方法可以分为水解酶和氧化还原酶方法两大类，此外还有转移酶、裂解酶。

水解酶是催化水解反应的酶，通常用金属沉淀法给其定位，在它的孵育液中含有酶的底 物和捕捉剂。生物组织在孵育液中进行孵育时，依次发生两个反应。第一个反应是酶促 水解反应，酶催化底物水解，生成的水解产物即为初级反应产物。这种水解产物通常是非 电子致密物质；第二个捕捉反应是水解产物与相应的捕捉剂发生反应，形成电子致密的、 不溶的最终产物。

另一大类酶是氧化还原酶，包括氧化酶和还原酶两类。此类酶参与生物体内的氧化还 原反应，与呼吸和酵解过程有关。在氧化还原酶的电镜细胞化学方法中，它们同时催化一对 氧化还原反应，在反应中一个底物被还原，另一个底物被氧化。这两个底物中的一个是酶的 生理底物，另一个是专门选择的试剂，在它被氧化或还原时会发生特殊的化学变化，使酶得以 定位。这种专门选择的底物在细胞化学反应中的作用与捕捉剂相似，因此也是捕捉剂的一种， 有人习惯称其为捕捉底物。

在氧化酶的电镜细胞化学反应中，氧化酶的生理底物是氧或过氧化氢，在酶促反应中，将一 个氧原子转移到捕捉底物上，捕捉底物被氧化。捕捉底物进一步反应，生成一种电镜下可见的 不溶性物质。如现采用较多的二氨基联苯胺法（DAB）法，即属此类反应。在此法中3，3'－二 氨基联苯胺作为捕捉底物。DAB很容易氧化聚合，经过一系列化学变化，生成嗜锇性很强的氧化 聚合物，经锇酸后固定后，生成电子密度很高的锇黑。

过氧化物酶是一种氧化还原酶，如辣根过氧化物酶，它们必须以由过氧化物来的氧进行氧化 作用，在反应中有两种底物，即过氧化氢和通常是联苯胺系的试剂。过氧化氢是生理底物， 为受氢体，而联苯胺系试剂为捕捉底物，为供氢体。

碱性磷酸酶主要位于细胞膜，在小肠上皮微绒毛和肾小管上皮刷状缘部位特别明显， 是细胞膜的标志酶之一。它能水解磷酸单酯而释放出磷酸。这种酶在pH9左右的碱性范 围内具有活性。在光镜细胞化学中，这种酶的捕捉剂是钙盐。在pH9.2～9.8时，底物甘油 磷酸钠水解，释放出磷酸，磷酸和捕捉剂氯化钙反应生成磷酸钙沉淀。Reale和Lucjano（1967） %\cite{应国华-1993，\cite{张景强-1993}，\cite{刘能保-2003} 将此法改进，在孵育液中加入 硝酸铅，结果形成磷酸铅沉淀，应用于电镜细胞化学中。但在碱性条件下，硝酸铅会生 成过量的沉淀，使反应产物严重扩散和可能的非酶促铅沉淀，所以现在不用这种铅－钙单 位沉淀法，而用在碱性pH范围内稳定的柠檬酸铅法。具体方法如下：

• 固定、切片见酸性磷酸酶； * 洗涤：用0.1M的二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4）,

4℃浸洗2～24小时 * 孵育：孵育液配方及孵育条件见表\ref{table:Enzyme-2} * 漂洗：孵育后，样品用0.12M的Tris-HCl缓冲液漂洗两次，共30min左右； * 后固定：同上

• 常规脱水、树脂渗透、包埋，超薄切片。 *

对照实验的孵育液中不加β－甘油磷酸钠或加终浓度为0.01M的氟化钠抑制剂； * 双染色或直接观察。

孵育配方见表table:Enzyme-2
    孵育液配方：  0.2M Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）     1.4 ml
                0.5%柠檬酸铅（捕捉剂(pH 10)）  4.0 ml
                3%β-甘油磷酸钠   2.0 ml
                蔗糖                        0.8 g
                0．015M硫酸镁               2.6ml 
 
  孵育条件： 孵育液pH                      9.0～9.4
            孵育温度                       37℃或室温 
            孵育时间                        15～30 min\

乙酰胆碱酯酶

主要分布于神经系统、肌肉和红细胞等组织中，常定位于神经细胞的内质网、核膜和 突触间隙等部位。它能使乙酰胆碱分解。显示乙酰胆碱酯酶的电镜细胞化学方法有多种， 如Karnovsky和Roots（1964）的铜－铁氰化物法。方法中以碘化乙酰硫代胆碱为底物，在 乙酰胆碱酯酶的作用下，释放出硫代胆碱。硫代胆碱的游离－SH基能将铁氰化物还原成亚 铁氰化物，后者可与许多金属离子（如铜离子）（捕捉剂）形成不溶的金属盐，在电镜下 可观察。因铁氰化物难以渗入组织，此法不适用于致密组织，只适合于具有开发结构及许多 胞外空间的组织，如外周神经系统。具体方法如下{张景强-1993}，{刘能保-2003}：

• 固定：使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液配制固定液。固定时，组织块用 2％的戊二醛（pH

7.2）或4％的甲醛（pH 7.0）固定2～3小时；

• 用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液4℃浸洗过夜（中间换液3次左右）；洗涤后厚切片同上；
• 孵育：孵育液配方及孵育条件见表table:Enzyme-3
• 用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤；
• 常规锇酸后固定、脱水、渗透、包埋和超薄切片、双染色、电镜观察；
• 对照实验：孵育液中用水代替碘化乙酰硫代胆碱；并在二甲胂酸钠缓冲液和孵育

液中加入终浓度为0.01mM的毒扁豆碱和0.01mM的DFP，作为抑制剂抑制酶反应的发生。

孵育配方见表table:Enzyme-3

   孵育液配方： 碘化乙酰硫代胆碱（底物）      5mg 
             0.1M顺丁烯二酸缓冲液（pH6）   6.5ml 
             0.1M柠檬酸钠                  0.5ml
             5M铁氰化钾（捕捉剂）          1ml 
             蒸馏水（或抑制剂）             1ml

   孵育条件： 孵育液pH                       （6～7）
             孵育温度                       37℃或室温
             孵育时间                       30～60min

葡萄糖－6－磷酸酶（G－6－P酶）

G－6－P酶是内质网的主要标志酶。光面内质网中的葡萄糖-6-磷酸酶可将葡萄糖-6-磷酸水解 生成葡萄糖和无机磷，释放游离的葡萄糖进入血液，供细胞之用。肝细胞的一个重要功能是维 持血液中葡萄糖水平的恒定,这一功能就与葡萄糖-6-磷酸酶的作用密切相关。Von Gierhe病（糖原病I）在肝实质细胞内，大量聚集了糖原，研究发现就是细胞内内质网缺乏G－6－P酶。 最早Gomori（1949）在光镜下检出了G－6－P酶活性，后经Wachstein和Meisel {Wachstein-1956} 的改良提出了G－6-P酶活性检测法。Tice和Barrnet {Tice-1962} 于1962年把后者的方法用于电镜酶细胞化学。具体做法如下：

• 固定：G－6-P酶对固定剂的耐受性较差，所以戊二醛固定（浸润固定）时间，

不宜超过30min。配制固定液的缓冲液使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液或Tris－maleatae（pH 6.7）。固定后用缓冲液充分洗涤。厚切片方法同上；

• 孵育：孵育液配方及孵育条件见表\ref{table:Enzyme-4},

此法具有强染色性，但稍有扩散现象，为了避免扩散，适当减少底物的量。在pH5.0以下，酶活性完全被抑制

• 充分洗涤、后固定及电镜标本制备同上。
• 对照实验可加入Hg^{2 +} （1mM）、NaF（20mM）、Cu^{2 +} (1mM)、Zn^{2 +} （10mM）和CN ⁻ （10mM）

等抑制剂或从孵育液中去除底物。

孵育配方见表table:Enzyme-4

    孵育液配方： 0.2M Tris－maleate pH6.7           20ml 
                葡萄糖－6－磷酸二钾或二钠(底物)     25mg 
               2％硝酸铅（捕捉剂）                  3ml 
               蔗糖                               4g 
              蒸馏水                              27ml
   
 孵育条件： 孵育液pH                     6.7左右
          孵育温度                          37℃
          孵育时间                         30min

G－6－P酶电镜细胞化学方法除了此法外，还有Kanamura和Wanson等方法。 {小川和朗-1991}。

5'－核苷酸酶（5'－N酶）

只水解5＇-核苷酸，生成核苷及无机磷酸。这种酶分布较广泛，所有的生物细胞膜包括微生物在 内，均具有5'－N酶。它被广泛应用于分析细胞匀浆的组分时，鉴定细胞膜的纯度，是细胞膜的 主要标志酶。酶活性的显示是由底物中的腺苷酸水解后释放的磷酸基被重金属捕捉后，生成电子 高密度、电镜下可观察的沉淀物。

• 固定：配制固定液的缓冲液可用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液（pH

7.2），固定液可用4％甲醛－钙，0℃固定24小时或2.5％戊二醛（0～4℃） 固定10～60分钟或4％多聚甲醛＋2.5%戊二醛混合液固定。

• 洗涤：用含7％～8％蔗糖的二甲胂酸钠缓冲液洗涤1小时（期间换液三次），后制成

30˜40μm的厚切片

• 孵育：孵育方法有几种：
  1. Wachstein-Meisel（1957）法见表\ref{table:Enzyme-5-1},

此方法由于硝酸铅浓度高，不可避免会出现浑浊，所以在组织及细胞间容易出现非特异 性沉淀，为了改善这种情况，可用下述改良方法。

• 1. Uusitalo和Karnovsky（1977）的改良法见表\ref{table:Enzyme-5-2}。

如仔细配制此液，可以得到完全没有浑浊的反应液。但应用铅盐作为捕捉剂，生成的颗粒 粗大，分布不均匀，所以现在很多5'－N酶用铈法。

• 1. 铈法：显示5'-N酶的捕捉剂，一般都用铅盐，但有反应液的配制困难或非特异性染

色等缺点。为了改善这种状况，现又有方法用氯化铈或硝酸铈代替铅盐的方法，得到了较好 的效果。

• 洗涤和后固定、脱水等步骤同上；
• 对照实验：对照组除在孵育液中去除底物AMP外，一般还必须加入抑制剂。抑制剂

可选用：2'－磷酸腺苷或3'，5'－磷酸腺苷做竞争性抑制剂，也有人用25uM的α,β-亚 甲腺苷5'－二磷酸，这样可完全抑制5'-核苷酸酶的活性。此外，由于经常会有碱性磷酸 酶同时存在的可能，应考虑加入0.5～2mM左旋咪唑使之消失。

第一种孵育配方table:Enzyme-5-1 \begin{tabular}{c c c}

孵育液配方： AMP（腺苷－5'－磷酸）（底物） 25mg

   0.2MTris－顺丁烯二酸盐缓冲液 （pH 7.2）         20ml
   0.1M硫酸镁                                       5ml
   2％硝酸铅(捕捉剂)                              3ml
   蒸馏水                                          22ml

孵育条件： 孵育液pH 7.2

          孵育温度                              37℃

孵育时间                        30～60min

第二种孵育配方table:Enzyme-5-2

孵育液配方： AMP（腺苷－5'－磷酸）（底物） 5.6mg

            0.2MTris－顺丁烯二酸盐缓冲液 （pH 7.2）  9.82ml
          硫酸镁                                     24.65mg
           0.1M硝酸铅(捕捉剂)                      0.18ml
           蔗糖                                     500mg

三磷酸腺苷酶（ATPase）

三磷酸腺苷酶将三磷酸腺苷（ATP）水解成二磷酸腺苷（ADP）和磷酸。在这个过程中，需 要依赖于不同的离子，这说明该酶的机能及局部分布可随组织不同而不同。在这类酶中，最 具代表性的是Na－K－ATPase或Ca－ATPase。这些ATPase一般都需要Mg^{2 +} 的存在，因此也将 这类酶称Mg－ATPase。在该酶的组化研究历史中，一定有关于由于孵育液的组成不同可能混 入非特异性反应等激烈争论的记载。因此，通常关于酶的显示，不应依靠单一的方法就确认 结果。如果将其看作是广义ATPase组织化学的组成部分，并于其他ATPase活性的显示结果慎 重比较研究，相信会得出很有价值的结论。

现已知动物组织中有许多ATP酶，其分布及定位可因激活剂与抑制剂的不同而有差异： 在肌球蛋白中，ATPase的激活剂是Ca^{2 +} ，最适pH是9，酶活性定位于A或Z带；细胞膜的 ATPase有的用Ma^{2 +} ，还有用Na ⁺ ，K ⁺ ，酶多见于质膜及某些血管内皮的吞饮小泡等处， 更多见于肾远、近端小管的刷状缘和质膜内等处；线粒体的ATP酶主要存在于线粒体的基质 和内膜的基粒。

下面将介绍中性硝酸铅法和碱性柠檬酸铅法。

• 固定：显示该酶的组织固定条件可因组织不同而不同，因此，固定

时可从单用多聚甲醛短时间固定到用4％戊二醛长时间固定，很难说哪一种 方法更恰当。但固定条件强弱的不同，可出现酶活性局部分布不同的结果。所 以，应首先十分明确研究目的。一般在0～4℃，单用4％多聚甲醛，或用2％多聚 甲醛加0.5%戊二醛，或单用2％戊二醛（含6～8％蔗糖）进行灌注固定或浸泡固定， 配制固定液的缓冲液大多使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液。固定时间可考虑 尽可能缩短；

• 洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲液数次；

而后进行厚切片；

• 孵育液：

硝酸铅法（Wachstein&Meisel）
的孵育液配方及条件见表\ref{table:Enzyme-6-1};
柠檬酸铅法1(Ogawa & Mayahara，1969)
的孵育液配方见表\ref{table:Enzyme-6-2};
柠檬酸铅法2（Ando等，1981）
的孵育液配方及条件见表\ref{table:Enzyme-6-3}。 *
锇酸后固定，脱水，常规电镜制样。 * 对照实验中可除去底物ATP钠盐。

硝酸铅法（Wachstein \& Meisel）孵育液配方 table:Enzyme-6-1

孵育液配方

     ATP钠盐125mg/ml）（底物）                   20ml
    0.2M Tris－Maleate缓冲液                    20ml
    0.1M MgSO4                               5ml
    2%硝酸铅（水溶液）（捕捉剂）                  3ml
    蒸馏水                                        2ml
 
    孵育条件：    

    孵育液pH                     7.2
   孵育温度                         37℃
    孵育时间                       30～60min

注意事项：ATP钠盐的最终浓度可根据活性强度在0.83mM与3mM之间进行调整；加硝酸铅时 须在搅拌的同时，将硝酸铅逐滴滴加，否则容易立即变浑浊。即使如此，也常见孵 育液自身轻度浑浊，故使用前过滤为好。

柠檬酸铅法1（Ogawa \Mayahara, 1969）孵育液配方table:Enzyme-6-2

  0.2M Tris-HCl缓冲液                   1.4ml
  蔗糖                                     0.8g
  ATP钠盐                                 18mg
  0.015M MgSO4                        2.6ml
  5%柠檬酸铅（溶于35M NaOH）              4ml
  蒸馏水                                   2ml

注意事项：柠檬酸铅溶解时间较长，故须于孵育前1～2小时制备，为避免混入二氧化碳， 须用密封容器。若搅拌充分并加温至37℃则溶解快些。在配制孵育液时，滴加铅溶 液的速率也不能太快，以免引起浑浊。

柠檬酸铅法2（Ando等，1981）的孵育液配方及条件table:Enzyme-6-3

  孵育液配方： &1M甘氨酸－KOH缓冲液 pH9.0         2.5ml
    左旋咪唑                                       6.02mg
    ATP钠盐                                        18mg
    0.1M MgSO4                                 1ml
    10M 柠檬酸铅（溶于50MKOH中）                    4ml
    蒸馏水                                           2.5ml

孵育条件：

孵育液pH 9.0～9.4

孵育温度                     37℃

孵育时间 30～60min

注意事项：甘氨酸缓冲液配制时可先用蒸馏水配好1M甘氨酸，然后滴加1M KOH，将pH调整至9.0或以上。该缓冲液不能保存，必须使用前配制，也可 用NaOH代替KOH。如pH高于9.0～9.4，则不能排除非特异性碱性磷酸酶活性的可能， 在这种情况下，虽然使用了碱性磷酸酶的抑制剂左旋咪唑，但仍需注意这种特异性 抑制剂对肠道上皮细胞及部分癌细胞的碱性磷酸酶无效，此外，可用溴化四咪唑 （0.5mM）或四咪唑（0.5mM）代替左旋咪唑；

腺苷酸环化酶

腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。它也是一种磷酸酶， 能催化ATP形成3'，5'－环磷酸腺苷（cAMP）并释放出焦磷酸。Howell等人（1972） 首先用亚胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进 行了定位。现已确认，在未固定和固定的组织中，ATP－PNP是腺苷酸环化酶的专一性底 物，在腺苷酸环化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应，生成一种不 溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性，为克服这一缺点， Fujiomto等（1981）设计了使用二钾亚砜（DMSO）的硝酸铅法。 下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。

• 固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M

pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含8％蔗糖、5％的DMSO。固定液配方： 2％多聚甲醛和0.25％戊二醛混合液。对于肝脏来说，1％以上的戊二醛固定时， 可导致明显的酶失活。但若加5％的DMSO，酶活性能较好保存。总体来说，多聚甲醛 与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0～4℃固定2小时或室温固定1小时。 * 洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲液数次； 而后进行厚切片；

• 孵育：配方及条件见\ref{table:Enzyme-7},

作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP－PNP在室温中或长期冷冻保存时，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性，在碱性磷酸酶活性 高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂， 应根据组织不同进行前处理后，将氟化钠加入到孵育液中。

• 后固定：后固定前，必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤，

残存的DMSO可以与锇酸反应，产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓 冲液配制的1％～2％的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为 固定时间不应超过10min，超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由于全 部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟 内。也有用2～4％的戊二醛代替锇酸进行后固定。

• 对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

DMSO的硝酸铅法孵育液配方及条件table:Enzyme-7

     孵育液配方：& Tris－顺丁烯二酸缓冲液（pH 7.4）     80mM
                   蔗糖                                 8％
                   氟化钠                              20mM
                   茶碱                                2.0mM
                   AMP－PNP                         0.5mM
                   硫酸镁                              4.0mM
                   左旋咪唑                            2.5mM
                   DMSO                           5％（V/V）
                   硝酸铅                              2.0mM

孵育条件： 孵育液pH 7.4

          孵育温度                     37℃
           孵育时间           轻微振荡30～60min

过氧化物酶

生物界中存在许多过氧化物酶，如辣根过氧化物酶、髓过氧化物酶等，它们能利用过氧化 物作氧源以氧化各种有机化合物。过氧化物酶存在于许多细胞中，髓过氧化物酶位于粒细 胞和单核细胞的内质网、核膜和细胞质颗粒中，是这些细胞器的标志酶。辣根过氧化物酶广泛 存在于植物中，尤其以辣根中最多。生理作用可能与NADH的有氧氧化、植物成熟激素、木质 素等的生物合成有关。

对氧化酶的细胞化学反应中现在采用较多的是二氨基联苯胺（DAB）法，此法中，3,3'-二 氨基联苯胺作为捕捉底物。DAB很容易氧化聚合，经过一系列化学变化生成一种噬锇性很强 的氧化聚合物，经锇酸固定后生成电子密度很高的锇黑，电镜下可见。下面以髓过氧化物酶 为例介绍过氧化物酶的电镜细胞化学方法：

• 固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M

pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含7％蔗糖。固定液配方：2％戊二醛。一般在0～4℃固定1小时左右。

• 洗涤：用Tris－HCl缓冲液（pH7.4，含7％蔗糖）漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲

液数次；而后进行厚切片；

• 孵育：

   为了使DAB充分浸透，将切片浸入预孵育液中37℃预孵育，10～30分钟，然后浸入孵育液中孵育。

孵育液及预孵育液的配方及条件见\ref{table:Enzyme-8}, 注意遮光孵育，DAB－4HCl溶于蒸馏水时，如果呈现淡红褐色，则应过滤，这是由于光 线照射引起的自动氧化所致，因此，孵育过程中应注意避光进行。 * 后固定：后固定前，必须用二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。后固定用二甲胂酸钠缓冲 液配制的1％～2％的锇酸，在4℃固定1小时左右，植物材料可考虑延长后固定时间。

• 对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

{过氧化物酶DAB法孵育液配方及条件}\label{table:Enzyme-8}

       预孵育液配方：  DAB－4HCl                       5mg
                     50mM Tris－HCl缓冲液（pH7.6）      9.9ml

       孵育液配方：    DAB－4HCl                     10mg
                     50mM Tris－HCl缓冲液             9.9ml
                     1％H2O2                        0.1ml

       孵育条件：    孵育液pH                         7.6
                     孵育温度                            37℃
                     孵育时间                   1小时

琥珀酸脱氢酶（SDH）

这是三羧循环过程中的一个主要酶。仅位于线粒体中，因此可作为线粒体的标志酶。 在光学显微镜组织化学上可用琥珀四唑盐还原来证明，电镜细胞化学也可用这方法，但 目前大多采用金属盐法，即Ogawa铁氰化物法。

这方法中用铁氰化钾作为电子受体，铁氰化钾将被还原为亚铁氰化钾，被铜离子俘获， 而产生不溶解的、电子致密的亚铁氰化铜。最后，高电子密度的亚铁氰化铜应沉淀于线 粒体内膜、嵴和嵴间隙。其反应见图\ref{fig-Enzyme-SDH} ：

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=5cm] {fig-Enzyme-SDH} \caption{琥珀酸脱氢酶（SDH）Ogawa铁氰化物法}\label{fig-Enzyme-SDH} \end{figure}

具体做法：

• 固定：0．25％戊二醛和1%甲醛，4℃,30分钟或用4％甲醛，4℃．5分钟 *

孵育： 用亚铁氰化铜法显示SDH的孵育液成份及孵育条件见\ref{table:Enzyme-9}：

• 对照： 对检验方法特异性应设置对照。常用的对照实验有：
  1. 无底物对照。在孵育液中不加底物琥珀酸钠；
  2. 酶抑制对照。常用的抑制剂为丙二酸钠(36mmol／L)。抗菌素A(1-30ug／L)或鱼

藤酮(33-330umol／L)。将上述抑制剂加到孵育液内。抗茵素A需预先溶在0.2ml无水乙醇 中，而鱼藤酮则需预先溶于0.2m1丙酮中。此时双蒸水的量应相应减至0.2m1。

亚铁氰化铜法显示SDH的孵育液成份及孵育条件table:Enzyme-9

    成  份                       用量         终浓度
   琥珀酸钠                      l00mg      l8mmol/L
 0．1mol／L磷酸缓冲液(pH 7．0) 13m1        65mmol／L
0．1mol／L柠檬酸钠            0．6m1        3mmol／L

30mmol／L硫酸铜 2．0ml 3mmol／L 双蒸水 2．4 ml 5mmol／L高铁氰化钾 2．0 ml 0．5 mmol／L 蔗糖 2-3g 0.29～0.44 mmol／L

孵育条件： 孵育液pH 7.0

                      孵育温度                      37℃
                      孵育时间                 10～60分钟

注意：按孵育液配方顺序将上述成份混合，并不断搅拌，待完全溶解后才加高铁氰化钾。 最终体积为20ml。配制时要不断振动。在孵育液中加入二甲基亚矾(DMSO)可加速孵育液成份向 组织内的浸透。在孵育液内加入0.5~0.8mmol儿的PMS(phenazine methosulfate)能减少假阳性并增加反应产物的电子密度。在存在PMS时，孵育应在暗处进行。

细胞色素氧化酶

细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链末端的酶，普遍存在于线粒体内，位于线粒体内膜 包括嵴膜的外表面。它催化的反应式见图\ref{fig-Enzyme-Xibaosesuyanghuamei} ：

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=0.7cm] {fig-Enzyme-Xibaosesuyanghuamei} \caption{细胞色素氧化酶催化反应}\label{fig-Enzyme-Xibaosesuyanghuamei} \end{figure}

细胞色素氧化酶的检出可用Seligman（1968）的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）四盐酸法。 在细胞色素氧化酶的化学反应中，DAB将氧化型细胞色素C还原，还原型细胞色素C又被细胞 色素a再氧化。通过这一循环，DAB不断被氧化的同时，在酶的活性部位上不断沉积DAB氧化 物。而DAB氧化物含有活性游离基又能使四氧化锇还原程电镜下可见的锇黑。 具体做法如下：

• 固定：用$2.5\sim3\%$戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液，pH 7.4），4℃浸润

固定20分钟，血管灌注固定10分钟。 * 洗涤：冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）充分洗涤1小时以上，中间需换液三次，洗涤后制成40um厚度的切片；

• 孵育：孵育液配方及孵育条件见\ref{table:Enzyme-10}；
• 后固定：用冷的1％锇酸（0.1mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液配制）固定1小时，将组织细胞固定的同时，DAB氧化与四氧化锇反应成高电子密度的锇黑。
• 后固定后，进行超规超薄切片样品处理。
• 对照：在孵育液中加入2mmo/L的KCN或者$10mmol/LNaN_{3}$应能，抑制酶反应。

\begin{table}[htbp]

 \centering

\caption{ DAB－四盐酸法显示细胞色素氧化酶的孵育液成份及孵育条件}\label{table:Enzyme-10} \begin{tabular}{c c c}

   \hline

孵育液： & 0.1mmol/L磷酸缓冲液或者PBS(pH7) & 10ml\\ &DAB一4HCl盐 & 10mg\\ &细胞色素C & 10mg\\ &过氧化氢酶 & 10mg\\

   \hline

孵育条件： &37℃不断振荡 & 60分钟\\ \hline \end{tabular} \end{table} 注意：DAB－4HCl盐溶于蒸馏水时，如果出现淡红褐色，则应过滤，孵育宜在避光处进行。

过氧化氢酶

过氧化氢酶是微体的标志酶。在过氧化氢酶分子中，存在两种酶活性，过氧化氢酶活性和 过氧化物酶样活性。这两种酶均具有分解双氧水的能力。当用甲酰胺、尿素、二氨基联苯 胺（DAB）、碱等处理时，过氧化氢酶活性消失，反而会出现过氧化物酶样活性。

过氧化氢酶是过氧化氢的清除剂，可分解过氧化氢产生氧和水。在H_2O_2存在下，过氧化氢酶也可催 化醇、酚、亚硝酸盐，醛、甲酸等的过氧化反应。在电镜细胞化学常中用碱性DAB-H_2O_2法显示此酶， DAB氧化物沉淀再经饿化。过氧化氢酶对戊二醛的耐受性较强，因此较易检出。经以下方法处理后，可 见在微体内出现高电子密度的锇黑。此方法的具体步骤为：

• 固定：2％～3％戊二醛(溶于PBS)，pH7．4，在4℃下至少固定3～4小时甚至过夜，并不断振动。

固定越充分越提高过氧化氢酶的特异性，充分固定对细胞色素氧化酶有抑制作用。

• 洗涤：为防止来自线粒体细胞色素C的假过氧化物的酶反应，固定后需要充分水洗，

因为细胞色素C为水溶性物质，经过充分水洗可除掉夹杂反应。用磷酸缓冲液洗涤60分钟以 上，最好过夜，换液三次，洗涤后制成30－40um厚切片进行孵育。

• 孵育：孵育液配方见\ref{table:Enzyme-11}。 孵育条件：

先在预孵育液中孵育10分钟。再在孵育液pH为中性的溶液A中，室温下孵育10分钟，然后 转入pH为9.7的孵育液B，在37℃下孵育60分钟，并不断振动。经PBS冲洗后用锇酸后固定。 预孵育液和孵育液的pH值可用氢氧化钠来调节，提高反应液的pH值（8.5～10.5）、增加 H_2O_2浓度。遮光下进行孵育是本法的关键。

• 洗涤: 用冷的磷酸缓冲液充分洗涤
• 后固定：用1％四氧化锇固定60分钟，使氧化沉淀物变为锇黑。
• 对照：样品在含0.5mg／m1过氧化氢酶的无H_2O_2的DAB介质中孵育，以排除介质中的内源性过氧化物。

碱性DAB-H2O2法显示过氧化氢酶的孵育液成份table:Enzyme-11

   预孵育液组成： DAB·4HCl盐               100mg
                  双蒸水                     1ml
            0.05mol/L 2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇          9ml

孵育液

  A      30％H2O2                    1ml
          PBS                       29ml

  B      DAB·4HCl盐                 30mg
        双蒸水                        12ml
     0.1mol/L 2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇       15ml

30％H_2O_2 1ml 0.1 mol/L NaOH 2.1ml

胆碱乙酰转移酶

胆碱乙酰转移酶(ChAc)催化乙酰辅酶A和胆碱之间的反应：

  乙酰辅酶A十胆碱--辅酶A十O一乙酰胆成碱

主要存在于神经系统，与乙酰胆碱合成有关，也可在胎盘，角膜上皮，细胞与 血小板膜中找到，可能与跨膜运输有关。生化分析表明，胆碱乙酰转移酶同乙酰 胆碱的分布极其相似，故可作为乙酰胆碱性神经的标记酶。 在电镜下显示ChAc可用铁氰化物还原法，其原理见图\ref{fig-Enzyme-ChAc}：

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=5cm] {fig-Enzyme-ChAc} \caption{铁氰化物还原法原理图}\label{fig-Enzyme-ChAc} \end{figure}

在这方法中，乙酰辅酶A（Acetyl－CoA）失去乙酰基变成CoA－SH后，高 铁氰化物被还原，变成亚铁氰化物，这种亚铁氰化物捕捉重金属（如钴），在酶 的活性部位沉淀。脑神经细胞的细胞膜、线粒体膜、高尔基体、内质网、突触间 隙和突触小泡均可发现酶的活性。这方法的具体做法如下：

• 固定：固定液有两种，配方见表\ref{table:Enzyme-12-1}，

胆碱乙酰转移酶的活性很容易被戊二醛破坏而失活。此外，为了保护底物， 也有在固定液1中加入乙酰辅酶A60mmol/L，氯化胆碱5mmol/L。 固定液2主要用于后固定中使用，使用时，将A，B，C三种溶液按以下比例混合：\\

2ml A液＋2ml B液＋5ml C液＋0.45g蔗糖，最后加蒸馏水至10ml。\\
一般在固定液1中，4℃固定10～30分钟，

组织化学产物反应仍比较弱，则可将样品先在孵育液中反应15～20分钟，再直接将样 品加入固定液2中进行固定，酶活性会清楚显示出来。

• 孵育：孵育液配方配方见表\ref{table:Enzyme-12-2}，

加双蒸水至总量为10ml。孵育条件为pH：6.8，温度：室温，时间：30～60分钟

• 洗涤：用含10％蔗糖的100mmol/L磷酸缓冲液在4℃充分洗涤1小时，期间换液数次。
• 后固定主要用固定液2，4℃固定30～60分钟
• 对照：可将孵育液中的底物(乙酰辅酶A)和氯化胆碱取消后进行反应，孵育

样品。此外，液可在反应液中加入SH基抑制剂3mmol/L N－乙基－顺丁烯二酰亚胺或碘醋酸钠，或加入胆碱乙酰转移酶的抑制剂40mmol/L氯化四甲铵或1～10mmol/L N－羟乙基－4－（1－萘乙烯）溴化吡啶。添加抑制剂时，孵育液的pH值一定要调整。

\begin{table}[htbp]

 \centering

\caption{铁氰化物还原法显示胆碱乙酰转移酶固定液成份} \label{table:Enzyme-12-1} \begin{tabular}{p{9em} c c}

   \hline

固定液1， &多聚甲醛 & 4g \\

   &蒸馏水    &                                 40ml \\

&1mol/L氢氧化钠 & 4滴\\

 \hline

60℃以下加热溶解后，水浴冷却&&\\

 \hline
  & 200mmol/L磷酸缓冲液 &                      50ml \\
   &蔗糖  &                                      4g \\

&1％氯化钙 & 10滴\\

 \hline
           混合溶解过滤后，加蒸馏水至100ml，调整至pH7.2。&&\\
 \hline
       固定液 2，A液：&巴比妥钠 &                              14.7g \\
                 &醋酸钠    &                              9.7g \\
           &用蒸馏水溶解，并加至总量为：&                 500ml \\
 \hline
           B液： &35％盐酸 &                              1.0ml \\
                 & 或10％盐酸  &                          4.0ml \\
                  &加蒸馏水至       &                      100ml \\
 \hline
C液：& 2％锇酸&     \\

\hline \end{tabular} \end{table}

\begin{table}[htbp]

 \centering

\caption{铁氰化物还原法显示胆碱乙酰转移酶孵育液成份} \label{table:Enzyme-12-2} \begin{tabular}{ c c}

   \hline

100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0） & 6ml\\ 乙酰辅酶A & 5.0mg\\ 100mmol/L氯化胆碱 & 1.0ml\\ 100mmol/L柠檬酸钠 & 0.3ml\\ 30mmol/L氯化钴 & 1.0ml\\\ 5mm0l/L高铁氰化钾 & 1.0ml\\ tetraisopropyrophosphoramide & 3.4mg\\ 蔗糖 & 1.5g \\ \hline \end{tabular} \end{table}

糖类的电镜细胞化学

多糖的电镜细胞化学

在光学显微镜中，显示多糖常用高碘酸--Schiff（PAS）反应。在这个反应中使用的高碘 酸是一种强氧化剂，通过高碘酸的氧化作用，打开多糖分子结构各单体内乙二醇中的碳－碳 （C－C）键形成醛基（见图\ref{fig-Enzyme-Schiff}）：

Image:.jpg[htbp] \centering \includegraphics[totalheight=3cm]{fig-Enzyme-Schiff} \caption{高碘酸--Schiff（PAS）反应}\label{fig-Enzyme-Schiff} \end{figure}

形成的醛基与Schiff试剂中的无色亚硫酸品红起反应，形成紫红色的沉淀。从沉

   淀的部位和数量判断多糖的存在的部位和多少。
   电镜细胞化学的原理与光学显微镜的基本一致，常用高碘酸－硫卡巴肼－蛋白银

（PA－TCH－SP）法显示。这方法用含有强还原基的硫卡巴肼（thiocar-bohydrazide,TCH） 代替Schiff试剂。为使反应可视化，还需蛋白银（Protein Silver）还原以获得高电子 密度的反应产物。 具体步骤如下：

• 固定：尽量使用醛类固定剂
• 常规包埋切片
• 孵育：
  • 所需器具和溶液：
    1. 镊网或金网，不用铜网
    2. 1％过碘酸水溶液
    3. 1％～2％TCH－20％醋酸溶液，1～2g硫卡巴肼（TCH），100ml的20％醋酸。

使用时将硫卡巴肼溶于20％醋酸，溶解后过滤。

• • 1. 5％、10％、20％醋酸溶液
    2. 1％蛋白银水溶液
  • 孵育步骤：
    1. 预孵育：将切片在1％过碘酸溶液中浸泡30分钟
    2. 双蒸水洗涤
    3. 孵育：1％～2％TCH溶液浸泡孵育60分钟
• 洗涤：10％醋酸洗涤数次后再换5％醋酸洗涤，然后再用双蒸水洗涤数次
• 显色：1％蛋白银浸泡60分钟，期间不断振动
• 双蒸水洗涤，干燥后观察。可以看到邻位羟基处出现高电子密度的反应产物。

注意事项：进行蛋白银染时，容器需用铝箔彻底遮光，容器可选用小型样品瓶。TCH可用氨基硫脲（thiosemicarbazide）代替。

复合糖类的透析铁染色法电镜细胞化学

这种方法主要以复合糖类醛基作为反应基础，复合糖类的负电基团与胶体铁反应， 形成具有高电子密度的复合物。具体操作步骤如下：

• 透析铁溶液的制备：将75g的三氯化铁细颗粒溶于250ml双蒸水，再加入100ml甘油，然

后边搅拌边滴加55ml的28％强氨水。将溶液注入透析袋，用双蒸水透析3天。透析铁原液和冰 醋酸以4：1混合。

• 将组织在2％戊二醛固定，固定后可用0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4），4℃

漂洗2小时以上或过夜。

• 厚切片：将组织用8％蔗糖水洗，振荡切片机或恒温冷箱切片机切片，片厚40um；
• 孵育：切片加入透析铁溶液，室温孵育18小时；
• 8％蔗糖水充分洗涤；
• 后固定：1％锇酸4℃固定1小时；
• 常规超薄切片样品制备
• 染色：用1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤干燥后观察
• 染色结果：在酸性基处出现高电子密度的透析铁沉淀。

复合糖类的高铁二胺染色电镜细胞化学

高铁二胺能与硫酸基特异性反应，因此含有硫酸基的复合糖类可通 过与高铁二胺起反应进行电镜细胞化学鉴定。

• 高铁二胺液的制备：将120mg的N－二甲基－间－苯二胺－二盐酸和20mg

的N，N－二甲基－对－苯二胺－盐酸共溶于50ml双蒸水，再加入40％三氯化铁－5％盐 酸溶液1.6ml，充分混合。

• 固定：用2％戊二醛常规固定后，用0.1mmol/L二钾砷酸钠（pH7.4），4℃漂洗2

小时以上或过夜； * 组织进行厚切片，片厚约40um；

• 用0.1mmol/L二钾砷酸钠缓冲液（pH7.4）充分洗涤；
• 孵育：将样品浸泡在高铁二胺溶液中，4℃，18～24小时，而后用缓冲液充分洗涤；
• 后固定：4℃1％锇酸固定1小时
• 常规脱水、树脂包埋，超薄切片，1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤，干燥后，电镜观察。含

有硫酸基的复合多糖类存在的地方将出现循环沉淀产物。

• 超薄切片若分别置于1％～2％TCH溶液和1％蛋白银水溶液浸泡于60min，则效果更佳。

脂类的电镜组织化学

细胞中所含的脂类除了富含磷脂的膜成分和以中性脂肪为主的脂滴外还存在着形态和机能 上位于膜和脂滴中间的膜结构即吞噬脂类的细胞器。通过分析这些脂类的存在的位置及其 形态结构结合生化分析可以了解高尔基体、内质网、溶酶体等细胞器为中心的脂质代谢的动 态变化过程。 对含脂类组织进行电镜细胞化学分析时常将具有脂类的组织或组分通过离心等方法将其进行分离， 然后进行以下实验小川和朗-1991：

• 将脂类组分用磷酸缓冲液稀释至浓度大约为100mmol/L，然后加4％锇酸固定

液5滴进行混合固定。约2min后，35000rpm超速离心30分钟，取沉淀块， 并用8.5%蔗糖水洗涤（静止放置10分钟）。然后用12.5%戊二醛固定15分钟；

• 8.5%蔗糖洗涤静放30分钟；
• 5％蔗糖－0.5醋酸铀进行块染15分钟（避光）；
• 8.5%蔗糖洗涤后进行常规脱水；
• 用QuetolMixturebaom聚合包埋；
• 超薄切片后进行铅染色，电镜下观察。

DNA的电镜组织化学

在光学显微镜水平下，利用Feulgen反应对DNA染色是特异性最好的细胞化学方法之一。其原理是利用Schiff型试剂将DNA酸水解 后暴露的脱氧核糖醛基进行检测。研究人员过去一直尝试找到电镜水平上的Schiff类试剂作为电子密度的标记物，结果发展了 一种在电镜水平上特异性显示DNA的技术。该技术利用锇的氨络合物作为反差试剂。锇的氨络合物染色方法已经用于冷冻切片 及Epon或Lowicryl包埋的切片，但此法的缺陷是锇－氨络合物不稳定。Olins等人对该法进行了改进，使形成的锇－氨 络合物更稳定。

另外一种简单的方法是利用低pH值下的磷钨酸（PTA）。该方法具有简单、便宜、快速和反差强的特点。但该法的特异性不高， 样品必须用乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）包埋，GMA是一种难以切片的包埋树脂。后一种缺陷可以通过块染， 然后再用环氧树脂包埋的方法克服。利用此法，已经在电镜水平上通过染色质的一些列切片得到了染色质的三维结构分布。该方法 也能与特异性抗原的免疫标记方法在同一切片上共同使用。下面介绍这两种方法的具体做法：

利用PTA方法对染色质染色

• PTA配制：将3克PTA溶解于100ml 1mol/L的盐酸中，使用时取10

～20ml，用1mol/L的NaOH调节pH值到2.1～2.5，即可使用。 对于单层培养细胞或用LR White包埋的样品，建议pH值选用2.84；

• 固定：用带有醛的固定液进行常规固定，不能使用锇酸固定；

• 若用EPON等环氧树脂包埋，则用3％的PTA进行块染 * 脱水切片等步骤按常规进行；

• 若用GMA包埋的材料制成的切片的载网，则在室温条件下孵育于3％的PTA上30～60分钟；

• 双蒸水冲洗，空气干燥。

DNA的锇－氨络合物染色

该技术对于醛固定的样品非常有效，但不适合于锇酸后固定的样品。切片必须不依赖支持膜而是直接放于金载网上。

• 醋酸染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于2.6ml双蒸水中，完全溶解后，加入2.4ml冰醋酸，然后加入

40mg的Na_2S_2O_5到溶液中溶解，使用前用一个密封性能好的塞子塞住30分钟。配好的溶液可以在同一试管中保存几周；

• HCl染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于4.8ml双蒸水中。完全溶解后，加入0.2ml的5mol/L的HCl溶液，然后加入40mg的Na_2S_2O_5到溶液中溶解，配好的溶液可以在同一试管中保存几周；
• 室温下将装有薄切片的未包被的金载网漂浮于5mol/L的HCl溶液上，室温下30分钟；
• 用双蒸水小心冲洗几次；
• 染色切片：室温下将载网浸入锇氨络合物－B的醋酸染色液或锇氨络合物－B盐酸染色液中，30～120分钟。有时要求在37℃染色1小时；
• 小心用双蒸水冲洗切片若干次，空气中干燥，用透射电镜观察。