目录 1 电子显微镜细胞化学 1.1 概述 1.2 电镜细胞化学的一般步骤及其注意点 1.2.1 一般步骤 1.2.2 注意事项 1.3 冷冻电镜细胞化学技术 1.4 电镜酶细胞化学技术 1.4.1 基本原理 1.4.2 电镜酶细胞化学的种类 1.5 应用举例 1.5.1 电镜酶细胞化学实验 1.5.2 糖类的电镜细胞化学 1.5.3 脂类的电镜组织化学 1.5.4 DNA的电镜组织化学

电子显微镜细胞化学

概述

电子显微镜细胞化学（Electron Microscopy Cytochemistry）主要用于研究细胞内各种成分在细胞超微结构水平的分布状态，以及这些成分在细胞中的定性、定量及代谢变化情况，目的是阐明各种细胞成分在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系。利用特定的化学显色反应，形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位，以显色的方式在细胞原位凸现出来，借助电子显微镜进行超微结构的原位分析。利用电镜细胞化学技术研究细胞的结构与功能，无需对所要研究的成分进行提取和分离就能获得组织和细胞内该成分的定位、代谢等大量信息。可将分子生物学、生物化学和超微结构研究等多方面有机地联系起来，在尽量保持细胞内固有结构的基础上显示分子生物学研究对象及其生化反应在细胞器、膜系统、大分子复合体等上的情况。

电镜细胞化学技术包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、电子显微镜放射自显影技术、离子细胞化学技术、示踪细胞化学技术及电子显微镜特殊染色技术等。根据细胞化学反应的原理，这些技术可以分为以下几类：

• 用特异的处理方法使组织和细胞上的电子透明物质产生电子致密沉淀物的方法。包括离子细胞化学技术，酶的电镜细胞化学，免疫电镜技术和免疫细胞化学技术等。
• 特异酶消化或特异溶剂提取法使原本存在的电子致密物质消失的鉴别方法，以反证其存在。如在组织、细胞固定前，预先用RNA酶、DNA酶消化，然后再用特异染色，电镜下在相应的部位出现空白区域以反证核酸的存在。如要鉴别脂肪可用有机溶剂进行处理。
• 被检测物本身是天然的电子密度较高的元素或化合物。常见的有铁蛋白、血红蛋白等。

电镜细胞化学的一般步骤及其注意点

一般步骤

主要包括取材、固定、厚切片、孵育和后固定、脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤。电镜细胞化学与纯形态学方法颇为相似。

• 取材

取材的方法和要求基本与形态学相同。在电镜细胞化学技术中，用灌注固定后再取材的方法对保存酶等物质的活性及定位较为理想。

• 固定

固定的好坏将直接影响到细胞超微结构的保存和细胞内化学成分的定位等，特别是组织和细胞内的酶等敏感的化学物质，在样品制备期间容易丢失、扩散或失去活性，因而必须采用适当的方法将它们的位置和活性进行固定。固定的作用可立即杀死细胞并把它的超微结构真实地保存下来外，还可改变细胞膜的通透性，促进孵育液中的各种成分顺利进入细胞内部，与所研究的物质成分发生化学反应，从而使该成分保存在原来的位置而不扩散或被洗去等。

但在制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾。若要保存好结构，则需充分固定，但固定越彻底，酶等物质失活越严重。为减少酶等物质的流失和活性损失，电镜细胞化学良好的固定必须满足以下条件：

• • 结构保存：组织块要新鲜，固定及时。
  • 机能保存：选择适当的固定方法和固定剂，防止酶等在固定、脱水等步骤中活性受到破坏。
  • 定位保存：避免细胞内成分使用常规固定方法后，在脱水、包埋等操作中容易扩散和流失，造成假象。

目前用于电镜细胞化学技术的固定剂常用多聚甲醛和戊二醛的混合液进行固定,如0.5%~2%戊二醛+2%~4%多聚甲醛。有时单用多聚甲醛也可以较好保存细胞超微结构保存，关键是取材后的标本应迅速固定。固定剂的醛类溶液必须很纯，一般要求1％的戊二醛水溶液A_235nm/A_280nm＜0.2，pH＞4，否则应对戊二醛进行提纯处理。

电镜细胞化学常用的缓冲液有醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲胂酸钠缓冲液。通常用缓冲液配制固定液、漂洗液和孵育液。固定液和漂洗液的pH为7.2～7.4，而孵育液的pH则随所研究的物质的不同而变化较大。电镜细胞化学对缓冲液的成分要求较高，选用缓冲液时，应根据所研究的物质来决定。如研究的成分或孵育液中含钙，则一般不用磷酸缓冲液，因其常常和孵育液中的成分产生沉淀，此时应选用二甲胂酸钠缓冲液（胂酸盐有毒）。又如Na^+对K^+依赖性磷酸酶有抑制作用，所有液体都应除去Na^+。Tris属于氨基的缓冲液，由于氨基和醛基能发生化学反应，所以不能同时使用。

有时需要在固定液中加入蔗糖、葡萄糖或聚乙烯吡啶烷酮（PVP）等调节固定液的渗透压，但必须控制好浓度。有时为了保护酶的活性和提高酶对固定剂的耐受性，有时还会在固定液或缓冲液中加入少量的底物（1～2mmol/L）。例如，当测定G－6－P酶时，通常在戊二醛固定液中加入1～2mmol/L的G－6－P底物，但添加底物的量不合适会导致反应产物的非特异性扩散。在某些情况下可在固定液或缓冲液中加入少量的赋活剂以保护酶等的活性，如非特异性碱性磷酸酶，在缓冲液中可加入少量的镁。但在实际应用中，一般很少添加底物和赋活剂。

固定的时间应以尽可能少地减弱研究物质如酶的活性同时又尽可能多地保存超微结构为原则。有些对固定剂很敏感的物质更应尽可能采用短时间的固定。如：葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PDH）仅能固定2min。游离细胞可直接加到固定剂或离心后加入固定剂。一般用于电镜细胞化学研究的样品块体积应小于0.5mm3。对于植物材料及一些具有致密结构的材料，组织块体积更应小些。

固定后，样品需充分漂洗，漂洗不干净往往会影响后面的反应。

• 厚切片

一般孵育液只能渗透组织表面40m左右，在固定漂洗后，常需将组织块在组织切片机上进行切片，制备成40m左右厚的切片。分离的细胞器、培养的细胞等不需进行厚切片。冷冻固定的组织用冷冻切片机切片。

• 孵育

孵育是组织和细胞与某种试剂在特定的条件下充分作用的过程，也是电镜细胞化学技术的关键步骤，对孵育液成分、选择合适的底物、良好的缓冲系统、最佳pH、适当温度以及孵育时间等都必须充分考虑。

孵育液各种成分的要求：各种孵育液的成分比例都有严格的范围，不能随便变更，以免扰乱溶液浓度；化学试剂起码是分析纯（AR）级，底物试剂最好放置于干燥器内，并置低温保存；吸水的化学试剂和药品必须密封，并保存于干燥器内。

孵育液配制：多数孵育液必须使用前新鲜配制，按配方顺序逐一加入各种试剂并不停搅拌（最好使用搅拌器）；所使用器皿要特别干净，避免使用、接触金属；加入含铅试剂等时，需缓慢滴加，同时不停搅拌，否则反应速率和效果都将不好；孵育液配制完毕后最好再次调整pH。

孵育时间和温度：虽然在0～4℃下孵育有利于保存超微结构，防止反应物的扩散，但有的物质如酶在此温度下无活性，因此一般孵育温度为37℃，主要根据细胞化学反应要求而定。孵育时间可因组织、细胞和所研究的物质种类而差异很大。如大鼠肝脏的Ca^2+－ATPase要求37℃ 30min，而显示ACP则需25min，心肌SDH仅需10min。总之，孵育时间最短，又能达到满意的反应结果为最好。若孵育时间过长，则易引起反应产物的弥散而产生假象；为把握好孵育时间和效果，最好在孵育过程中不同时间取出部分切片进行检查，以确定孵育时间。

孵育方法：对于冷冻切片来说可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育，一般的厚切片可直接放到孵育液中进行孵育。

孵育时常要根据拟测定的物质设置对照实验。

• 孵育后处理

一般在孵育后仍要用1％的锇酸进行30～60min的后固定，也有人在孵育完成后再用亚铁氰化钾还原锇酸代替锇酸作后固定，以提高最后结果的反差。后固定后一般可按常规处理。由于组织较薄，后固定、脱水、渗透与包埋时间可缩短。超薄切片染色时，有时可能会模糊细胞化学反应的细节。

• 对照实验

对照实验以消除扩散、吸附等原因可造成的假象或伴随反应。。

注意事项

电镜细胞化学技术的关键在于找到能与组织和细胞内物质进行特异反应的试剂，并应满足以下要求：

• 反应试剂与组织或细胞内被检测物质发生的反应必须具有特异性；
• 反应不损伤或破坏组织或细胞本身的超微结构；
• 反应的最终产物为电镜能观察的电子致密物，一般为微细的、颜色很深的沉淀物，而且在所研究物质的原位沉淀，在所有的制样和观察过程中不会改变位置；
• 反应具有可重复性。

由于电镜的分辨率高，反应最终产物的任何微细变化在超微结构上的变化就可能非常明显。因此电镜标本的制备方法的每个步骤都要十分精心操作和控制，以避免在超微结构水平上出现假象。

冷冻电镜细胞化学技术

快速冷冻样品可以将样品的自然生活状态尽快地保存下来，同时又极大地保存了所要研究物质的活性，基本满足了电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足的条件，较好地做到了结构保存、机能保存和定位保存，很好地解决了常规样品制备过程中遇到的矛盾。冷冻电镜细胞化学技术的具体步骤与常规的基本一致。详细技术见“冷冻切片技术”。

电镜酶细胞化学技术

基本原理

酶本身用常规的方法是不可直接观察到的，利用酶的特异组织细胞化学反应可将酶的位置等显示出来。酶的特异组织化学反应指酶具有只作用于该酶底物的反应（也有两种或两种以上的酶具有同种底物的情况）。利用酶的这种特性，在一定条件下，使细胞内的酶作用于酶的底物，将底物分解产物作为反应物质，在作用部位进行捕捉，形成可在电镜中进行观察的电子致密物，从而间接证明酶的定位。酶组织细胞化学反应越特异，对该酶在细胞内的定位也就越精确。酶的种类很多，目前已知有1000多种，能通过电子显微镜显示出来的酶数量大约不到100种，而且多为水解酶和氧化还原酶类。

电镜酶细胞化学技术正是利用酶的上述性质，通过电子显微镜、超薄切片技术等确定各种酶在细胞内的分布及其在细胞活动中的变化等。在设计电镜酶细胞化学实验时，对所研究的酶的各个性质进行充分的了解，对整个实验的成功将是非常必要的。

酶细胞化学反应过程可分两步，首先，在一定条件下使细胞内的酶作用于底物，形成初级产物（酶反应），再应用化学物质（通常称为捕捉剂）与初级产物反应，形成电镜下可见的物质（捕捉反应）。

底物：常用的底物有两种：

• 自然存在的底物：自然存在的底物能产生不溶性的电子致密物，主要应用于金属盐类以及检查单、二及三磷酸钠，也可用于高铁氰化物还原法检查特异的脱氢酶等。
• 嗜锇性的产物：理想的底物要求具备特点：水溶性，并在水中比较稳定；能与参与反应的其它混合物“相容”，并对作用酶没有抑制作用。

反应产物：电镜细胞化学反应应当在标本的特异部位最终出现具有高度反差的产物，因此初级反应产物经捕捉反应后生成的最终反应产物应具有高反差性能。它们可以是金属，也可以是酶反应产生的沉淀。理想的最终反应产物应具备的性能：均质、高电子密度、不被树脂和水及其它有机溶剂所溶解、不与组织或细胞相结合，不溶于脂肪，较少生成结晶，而且不易扩散等。

捕捉反应：作用是使初级反应产物经捕捉反应而变成最终反应产物以便进行电镜观察。由于捕捉反应很快，在100ms即可使初级反应产物与蛋白相结合，因此不至于造成明显的扩散。

对照实验：对照实验的要求是：

• 对照实验的取材必须与实验组的材料为同一组织、同一部位的材料。
• 对照组与实验组所使用的缓冲液、孵育液（除缺乏底物外）等溶液均应一致。
• 对照组应不加底物。把组织切片孵育在缺乏底物的孵育液中，细胞不出现反应或反应程度明显下降。如果组织存在内因性底物，即使不加底物，也会在某种程度上呈现阳性反应。所以孵育前必须充分漂洗，尽可能使内因性底物洗净。
• 在进行酶细胞化学反应时，应进行加热或添加抑制剂等处理，使酶失活；可逆性酶抑制剂经漂洗、孵育后酶可重新活化，因此必须选择非可逆性的酶抑制剂。
• 可将被测定物质用酶先进行消化、酰化或甲基化，使细胞不再起细胞化学反应。
• 可用已知阳性或阴性反应标本来检查未知标本进行对比观察。如有可能，应同时采用多种方法检查同一种物质，以增加实验的准确性。

电镜酶细胞化学的种类

从最终产物获得的反应方法可将电镜酶细胞化学分成：金属沉淀法、锇黑法和嗜锇性多聚体生成法等几种。

金属沉淀法：

金属沉淀法的原理及生成的最终产物是金属沉淀，这种产物溶解度越低越理想。因此常以Pb2+，Cu2+，Ba2+等金属元素作为酶的捕捉剂，由它们形成最终反应产物，如：磷酸铅、亚铁氰化铜、硫化钡等具有溶解度低、粒细、电子密度高等特点。其中铅盐是较理想的捕捉剂，其优点是：被检出的酶种类多（各种磷酸酶、酯酶和转移酶等）；在酸性、中性和碱性条件下均可使用；反应一次完成，不需置换反应；生成的产物颗粒小，不易流失。但铅盐也有缺点，如反应产物有时扩散，捕捉的量过高，可能与底物相结合，对酶活性有抑制作用，在反应液中促进底物的自然分解等。

锇黑法：

光镜细胞化学反应最常用的方法是色素法，包括偶氮色素法：即用α－醋酸萘酚、萘酚As－β－葡萄糖苷酸，β－萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物作为底物，这些底物与酯酶、磷酸酶、糖苷酶等酶发生反应，游离出萘酚并与重氮盐相结合（偶联），以偶氮色素沉淀于酶所在的部位。由于色素本身电子反差弱给观察带来困难，因此需要在最后一步用锇酸处理，使反应产物锇化形成锇黑。这种方法叫锇黑法。形成的锇黑反差强，图像清晰。锇酸不仅仅起固定细胞结构的作用，还使四氧化锇还原成锇黑。

嗜锇性多聚体生成法（亚铁氰化铜－DAB－四氧化锇法）：

嗜锇性多聚体生成法是由金属沉淀法、色素法和锇黑法几种方法相互结合而成。这种方法利用亚铁氰化铜的氧化和DAB的氧化偶联或聚合性质检测各种水解酶、氧化还原酶及裂解酶等。

应用举例

电镜酶细胞化学实验

• 酸性磷酸酶（ACP）

ACP酶是一种水解酶，常存在于溶酶体和高尔基体上。ACP常被看作是溶酶体的标记酶。

固定：ACP对固定剂的耐受性较强，但若研究溶酶体上的ACP酶时应考虑到溶酶体界膜不牢固，各种理化因素都会造成溶酶体界膜的损伤，使大分子酶颗粒或ACP酶的反应产物（小分子）从溶酶体流入细胞质，这样就导致酶定位错误，出现假象。为了避免这种假象，在研究溶酶体上的ACP时，通常采用较高渗的固定液（300～500mmol/L），对动物组织，可能的话应采用灌注固定5～10min。一般采用直接取材固定于预冷的固定液的方法，固定时间为1～2h。固定液配方： 2.5%戊二醛＋2％～4％多聚甲醛（终浓度）混合固定液；缓冲液： 0.1M二甲砷酸钠＋8％的蔗糖。

洗涤：用缓冲液洗涤1h或4℃过夜。为了使孵育介质中的底物、捕捉剂等物质迅速进入细胞内，在二甲砷酸钠缓冲液中常加入10％二甲基亚砜（DMSO），DMSO可使ACP酶的活性增强，对ACP酶活性不易检出的培养细胞的样品，效果更明显。

厚切片：将样品切成20~40m的切片。

孵育：孵育液配方及孵育条件见表1。

表1 孵育液配方及孵育条件 孵育液配方： 0.2M 醋酸钠缓冲液(pH 5.0) 硝酸铅（捕捉剂） 3% β-甘油磷酸钠 蔗糖 50 ml 50mg 5ml 4.0g 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 5.0～5.2 37℃ 30～60min

漂洗：孵育后，样品用0.1M的二甲砷酸钠缓冲液漂洗两次，共40～60min。

后固定：用预冷的1％锇酸，4℃浸润固定30～60min。

常规脱水、树脂渗透、包埋，超薄切片。

对照实验：在对照片中的孵育液中不加β－甘油磷酸钠或加终浓度为0.01M的氟化钠抑制剂；

对超薄切片进行铅－铀双染色，也可不染色直接观察ACP的定位。

• 碱性磷酸酶（ALP）

碱性磷酸酶主要位于细胞膜，在小肠上皮微绒毛和肾小管上皮刷状缘部位特别明显，是细胞膜的标志酶之一。它能水解磷酸单酯而释放出磷酸。这种酶在pH9.0左右的碱性范围内具有活性。目前常用在碱性pH范围内稳定的柠檬酸铅法。

• • 固定、切片见酸性磷酸酶。

洗涤：用0.1M的二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4）, 4℃浸洗2～24h。

孵育：孵育液配方及孵育条件见表2。

表2 孵育液配方及孵育条件 孵育液配方： 0.2M Tris-HCl缓冲液（pH 8.5） 0.5%柠檬酸铅（捕捉剂(pH10)） 3% β-甘油磷酸钠 蔗糖 0.015M硫酸镁 1.4ml 4.0 ml 2.0ml 0.8g 2.6ml 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 9.0～9.4 37℃或室温 15～30min

漂洗：孵育后，样品用0.12M的Tris-HCl缓冲液漂洗两次，共30min左右；

后固定：同上

• • 常规脱水、树脂渗透、包埋，超薄切片。

对照实验：孵育液中不加β－甘油磷酸钠或加终浓度为0.01M的氟化钠抑制剂；

• • 双染色或直接观察。

• 乙酰胆碱酯酶

主要分布于神经系统、肌肉和红细胞等组织中，常定位于神经细胞的内质网、核膜和突触间隙等部位。它能使乙酰胆碱分解。显示乙酰胆碱酯酶的电镜细胞化学方法有多种，如Karnovsky和Roots（1964）的铜－铁氰化物法。方法中以碘化乙酰硫代胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶的作用下，释放出硫代胆碱。硫代胆碱的游离－SH基能将铁氰化物还原成亚铁氰化物，后者可与许多金属离子（如铜离子）（捕捉剂）形成不溶的金属盐，在电镜下可观察。因铁氰化物难以渗入组织，此法不适用于致密组织，只适合于具有开发结构及许多胞外空间的组织，如外周神经系统。

固定：使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液配制固定液。固定时，组织块用2％的戊二醛（pH 7.2）或4％的甲醛（pH 7.0）固定2～3h。

用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液4℃浸洗过夜（中间换液3次左右）；洗涤后厚切片同上。

孵育：孵育液配方及孵育条件见表3：

表3 孵育液配方及孵育条件 孵育液配方： 碘化乙酰硫代胆碱（底物） 0.1M顺丁烯二酸缓冲液（pH6） 0.1M柠檬酸钠 5M铁氰化钾（捕捉剂） 蒸馏水（或抑制剂） 5.0mg 6.5ml 0.5ml 1.0ml 1.0ml 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 6.0～7.0 37℃或室温 30～60min

用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。

• • 常规锇酸后固定、脱水、渗透、包埋和超薄切片、双染色、电镜观察；

对照实验：孵育液中用水代替碘化乙酰硫代胆碱；并在二甲胂酸钠缓冲液和孵育液中加入终浓度为0.01mM的毒扁豆碱和0.01mM的DFP，作为抑制剂抑制酶反应的发生。

• 葡萄糖－6－磷酸酶（G－6－P酶）

G－6－P酶是内质网的主要标志酶。光面内质网中的G-6-P酶可将G-6-P水解生成葡萄糖和无机磷，释放游离的葡萄糖进入血液，供细胞之用。

固定：G－6-P酶对固定剂的耐受性较差，所以戊二醛固定（浸润固定）时间，不宜超过30min。配制固定液的缓冲液使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液或Tris－maleatae（pH6.7）。固定后用缓冲液充分洗涤。

厚切片方法同上；

孵育：孵育液配方及孵育条件见表4，此法具有强染色性，但稍有扩散现象，为了避免扩散，适当减少底物的量。在pH5.0以下，酶活性完全被抑制。

充分洗涤、后固定及电镜标本制备同上。

对照实验可加入Hg2+（1mM）、NaF（20mM）、Cu2+(1mM)、Zn2+（10mM）和CN-（10mM）等抑制剂或从孵育液中去除底物。

表4 孵育液配方及孵育条件 孵育液配方： 0.2M Tris－maleate pH6.7 葡萄糖－6－磷酸二钾或二钠(底物) 2％硝酸铅（捕捉剂） 蔗糖 蒸馏水 20ml 25mg 3.0ml 4g 27ml 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 6.7 37℃ 30min

• 5'－核苷酸酶（5'－N酶）

只水解5＇-核苷酸，生成核苷及无机磷酸。这种酶分布较广泛，所有的生物细胞膜包括微生物在内，均具有5'－N酶。它被广泛应用于分析细胞匀浆的组分时，鉴定细胞膜的纯度，是细胞膜的主要标志酶。酶活性的显示是由底物中的腺苷酸水解后释放的磷酸基被重金属捕捉后，生成电子高密度、电镜下可观察的沉淀物。

固定：配制固定液的缓冲液可用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2），固定液可用4％甲醛－钙，0℃固定24h或2.5％戊二醛（0～4℃）固定10～60min或4％多聚甲醛＋2.5%戊二醛混合液固定。

洗涤：用含7％～8％蔗糖的二甲胂酸钠缓冲液洗涤1h（期间换液三次），后制成30~ 40m的厚切片。

孵育：孵育方法有 Wachstein-Meisel（1957）法，Uusitalo和Karnovsky（1977）改良法和铈法。目前常用铈法：显示5'-N酶的捕捉剂，一般都用铅盐，但有反应液的配制困难或非特异性染色等缺点。为了改善这种状况，现又有方法用氯化铈或硝酸铈代替铅盐的方法，得到了较好的效果。

洗涤和后固定、脱水等步骤同上；

对照实验：对照组除在孵育液中去除底物AMP外，一般还必须加入抑制剂。抑制剂可选用：2'－磷酸腺苷或3'，5'－磷酸腺苷做竞争性抑制剂，也有人用25M的α,β-亚甲腺苷5'－二磷酸，这样可完全抑制5'-核苷酸酶的活性。此外，由于经常会有碱性磷酸酶同时存在的可能，应考虑加入0.5～2mM左旋咪唑使之消失。

表5 孵育液配方及孵育条件 孵育液配方： AMP（腺苷－5'－磷酸）（底物） 0.2M Tris－顺丁烯二酸盐缓冲液（pH 7.2） 硫酸镁 0.1M硝酸铅(捕捉剂) 蔗糖 5.6mg 9.82ml 24.65mg 0.18ml 500mg 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 7.2 37℃ 30～60min

• 三磷酸腺苷酶（ATPase）

中性硝酸铅法和碱性柠檬酸铅法。

固定：显示该酶的组织固定条件可因组织不同而不同，因此，固定时可从单用多聚甲醛短时间固定到用4％戊二醛长时间固定，很难说哪一种方法更恰当。但固定条件强弱的不同，可出现酶活性局部分布不同的结果。所以，应首先十分明确研究目的。一般在0～4℃，单用4％多聚甲醛，或用2％多聚甲醛加0.5%戊二醛，或单用2％戊二醛（含6～8％蔗糖）进行灌注固定或浸泡固定，配制固定液的缓冲液大多使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液。固定时间可考虑尽可能缩短。

洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1h～过夜，期间更换缓冲液数次。

• • 厚切片。

孵育液：硝酸铅法、柠檬酸铅法1和柠檬酸铅法2的孵育液配方及条件分别见表6、表7和表8。

• • 锇酸后固定，脱水，常规电镜制样。

• • 对照实验中可除去底物ATP钠盐。

表6 硝酸铅法（Wachstein & Meisel）孵育液配方 孵育液配方： TP钠盐125mg/ml）（底物） 0.2M Tris－Maleate缓冲液 0.1M MgSO4 2%硝酸铅（水溶液）（捕捉剂） 蒸馏水 20ml 20ml 5ml 3ml 2ml 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 7.2 37℃ 30～60min

注意事项：ATP钠盐的最终浓度可根据活性强度在0.83mM与3.0mM之间进行调整；加硝酸铅时须在搅拌的同时，将硝酸铅逐滴滴加，否则容易立即变浑浊。即使如此，也常见孵育液自身轻度浑浊，故使用前过滤为好。

表7 柠檬酸铅法1（Ogawa &Mayahara,1969）孵育液配方 孵育液配方： 0.2M Tris-HCl缓冲液 蔗糖 ATP钠盐 0.015M MgSO4 5%柠檬酸铅（溶于35M NaOH） 蒸馏水 1.4ml 0.8g 18mg 2.6ml 4.0ml 4.0ml

注意事项：柠檬酸铅溶解时间较长，故须于孵育前1～2h制备，为避免混入二氧化碳，须用密封容器。若搅拌充分并加温至37℃则溶解快些。在配制孵育液时，滴加铅溶液的速率也不能太快，以免引起浑浊。

表8 柠檬酸铅法2（Ando等，1981）孵育液配方 孵育液配方： 1M甘氨酸－KOH缓冲液 pH9.0 左旋咪唑 ATP钠盐 0.1M MgSO4 10M 柠檬酸铅（溶于50M KOH中） 蒸馏水 2.5ml 6.02mg 18mg 1.0ml 4.0ml 2.5ml

注意事项：甘氨酸缓冲液配制时可先用蒸馏水配好1M甘氨酸，然后滴加1M KOH，将pH调整至9.0或以上。该缓冲液不能保存，必须使用前配制，也可用NaOH代替KOH。如pH高于9.0~9.4，则不能排除非特异性碱性磷酸酶活性的可能，在这种情况下，虽然使用了碱性磷酸酶的抑制剂左旋咪唑，但仍需注意这种特异性抑制剂对肠道上皮细胞及部分癌细胞的碱性磷酸酶无效，此外，可用溴化四咪唑（0.5mM）或四咪唑（0.5mM）代替左旋咪唑；

• 腺苷酸环化酶

腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上，也是一种磷酸酶，能催化ATP形成3',5'－环磷酸腺苷（cAMP）并释放出焦磷酸。在未固定和固定的组织中，ATP－PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物，在腺苷酸环化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应，生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性，目前常用二甲基亚砜（DMSO）的硝酸铅法。

固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M pH7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含8％蔗糖、5％的DMSO。固定液配方：2％多聚甲醛和0.25％戊二醛混合液。对于肝脏来说，1％以上的戊二醛固定时，可导致明显的酶失活。但若加5％的DMSO，酶活性能较好保存。总体来说，多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0～4℃固定2h或室温固定1h。

洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1h～过夜，期间更换缓冲液数次；

厚切片；

孵育：作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP－PNP在室温中或长期冷冻保存时，ATP、AMP－PN和AMP－PNP－P等化合物容易增多，应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性，在碱性磷酸酶活性高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂，应根据组织不同进行前处理后，将氟化钠加入到孵育液中。

后固定：后固定前必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤，残存的DMSO可以与锇酸反应，产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1％～2％的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为固定时间不应超过10min，超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由于全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5min内。也有用2～4％的戊二醛代替锇酸进行后固定。

对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

表9 DMSO的硝酸铅法孵育液配方及条件 孵育液配方： Tris－顺丁烯二酸缓冲液（pH 7.4） 蔗糖 氟化钠 茶碱 AMP－PNP 硫酸镁 左旋咪唑 DMSO 硝酸铅 80mM 8％ 20mM 2.0mM 0.5mM 4.0mM 2.5mM 5％（V/V） 2.0mM 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 7.4 37℃ 轻微振荡30～60min

• 过氧化物酶

过氧化酶的细胞化学反应中现在采用较多的是二氨基联苯胺（DAB）法， 3,3'-二氨基联苯胺作为捕捉底物。DAB很容易氧化聚合，经一系列化学变化生成一种噬锇性很强的氧化聚合物，经锇酸固定后生成电子密度很高的锇黑，电镜下可见。以髓过氧化物酶为例介绍过氧化物酶的电镜细胞化学方法：

•固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M pH7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含7％蔗糖。固定液配方：2％戊二醛。一般在0～4℃固定1h左右。

•洗涤：用Tris－HCl缓冲液（pH7.4，含7％蔗糖）漂洗1h～过夜，期间更换缓冲液数次；

•厚切片；

•孵育：为了使DAB充分浸透，将切片浸入预孵育液中37℃预孵育10～30min，然后浸入孵育液中遮光孵育。DAB－4HCl溶于蒸馏水时，如果呈现淡红褐色，则应过滤，这是由于光线照射引起的自动氧化所致。

•后固定：后固定前，必须用二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1％～2％的锇酸，在4℃固定1h左右，植物材料可考虑延长后固定时间。

•对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

表10 过氧化物酶DAB法孵育液配方及条件 预孵育液配方： DAB－4HCl 50mM Tris－HCl缓冲液（pH7.6） 5mg 9.9ml 孵育液配方： DAB－4HCl 50mM Tris－HCl缓冲液 1％H2O2 10mg 9.9ml 0.1ml 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 7.6 37℃ 1h

• 琥珀酸脱氢酶（SDH）

SDH仅位于线粒体中，因此可作为线粒体的标志酶。电镜细胞化学目前多采用金属盐法，即Ogawa铁氰化物法。用铁氰化钾作为电子受体，铁氰化钾将被还原为亚铁氰化钾，被铜离子俘获，而产生不溶解的、电子致密的亚铁氰化铜。最后，高电子密度的亚铁氰化铜应沉淀于线粒体内膜、嵴和嵴间隙。

•固定：0．25％戊二醛和1%甲醛，4℃，30min或用4％甲醛，4℃，5min。

•孵育：用亚铁氰化铜法显示SDH的孵育液成份及孵育条件见表11。

•对照：对检验方法特异性应设置对照。常用的对照实验有无底物对照，即在孵育液中不加底物琥珀酸钠。酶抑制对照。常用的抑制剂为丙二酸钠(36mmol／L)。抗菌素A(1-30ug／L)或鱼藤酮(33-330mol／L)。将上述抑制剂加到孵育液内。抗茵素A需预先溶在0.2ml无水乙醇中，而鱼藤酮则需预先溶于0.2m1丙酮中，此时双蒸水的量应相应减至0.2m1。

表11 亚铁氰化铜法显示SDH的孵育液成份及孵育条件 孵育液配方： 琥珀酸钠 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0) 0.1M柠檬酸钠 30mM硫酸铜 双蒸水 5mM高铁氰化钾 蔗糖 l00mg（终浓度l8mM） 13m1（终浓度65mM） 0.6m1（终浓度3mM） 2.0ml（终浓度3mM） 2.4 ml 2.0 ml（终浓度0.5mM） 2-3g（终浓度0.29～0.44 mM） 孵育条件： 孵育液pH 孵育温度 孵育时间 7.0 37℃ 10～60min

注意：按孵育液配方顺序将上述成份混合，并不断搅拌，待完全溶解后才加高铁氰化钾。最终体积为20ml。配制时要不断振动。在孵育液中加入二甲基亚矾(DMSO)可加速孵育液成份向组织内的浸透。在孵育液内加入0.5~0.8mM的PMS(phenazine methosulfate)能减少假阳性并增加反应产物的电子密度。在存在PMS时，孵育应在暗处进行。

• 细胞色素氧化酶

细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链末端的酶，普遍存在于线粒体内，位于线粒体内膜包括嵴膜的外表面。细胞色素氧化酶的检出可用Seligman（1968）的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）四盐酸法。在细胞色素氧化酶的化学反应中，DAB将氧化型细胞色素C还原，还原型细胞色素C又被细胞色素a再氧化。通过这一循环，DAB不断被氧化的同时，在酶的活性部位上不断沉积DAB氧化物。而DAB氧化物含有活性游离基又能使四氧化锇还原程电镜下可见的锇黑。

•固定：用2.5~3%戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4），4℃浸润固定20min，血管灌注固定10min。

•洗涤：冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）充分洗涤1h以上，中间需换液三次，洗涤后制成40um厚度的切片；

•孵育：孵育液配方及孵育条件见表12。

•后固定：用冷的1％锇酸（0.1mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液配制）固定1h，将组织细胞固定的同时，DAB氧化与四氧化锇反应成高电子密度的锇黑。

•常规超薄切片样品处理。

•对照：在孵育液中加入2mmo/L的KCN或者10mmol/L NaN3应能，抑制酶反应。

表12 DAB－四盐酸法显示细胞色素氧化酶的孵育液成份及孵育条件 孵育液配方： 0.1mmol/L PB或PBS(pH7.0) DAB一4HCl盐 细胞色素C 过氧化氢酶 10ml 10mg 10mg 10mg 孵育条件： 37℃不断振荡 60min

注意：DAB－4HCl盐溶于蒸馏水时，如果出现淡红褐色，则应过滤，孵育宜在避光处进行。

• 过氧化氢酶

过氧化氢酶是微体的标志酶。在过氧化氢酶分子中存在过氧化氢酶活性和过氧化物酶样活性，两种酶均具有分解双氧水的能力。当用甲酰胺、尿素、二氨基联苯胺（DAB）、碱等处理时，过氧化氢酶活性消失，反而会出现过氧化物酶样活性。在电镜细胞化学常中用碱性DAB-H2O2法显示此酶，DAB氧化物沉淀再经饿化，在微体内出现高电子密度的锇黑。过氧化氢酶对戊二醛的耐受性较强，因此较易检出。

•固定：2％～3％戊二醛(溶于PBS)，pH7.4，在4℃下至少固定3～4h甚至过夜，并不断振动。固定越充分越提高过氧化氢酶的特异性，充分固定对细胞色素氧化酶有抑制作用。

•洗涤：为防止来自线粒体细胞色素C的假过氧化物的酶反应，固定后需要充分水洗，因为细胞色素C为水溶性物质，经过充分水洗可除掉夹杂反应。用磷酸缓冲液洗涤60min以上，最好过夜，换液三次，洗涤后制成30－40m厚切片进行孵育。

•孵育：孵育液配方见表13。孵育条件：先在预孵育液中孵育10min。再在孵育液pH为中性的溶液A中，室温下孵育10min，然后转入pH为9.7的孵育液B，在37℃下孵育60min，并不断振动。经PBS冲洗后用锇酸后固定。预孵育液和孵育液的pH值可用氢氧化钠来调节，提高反应液的pH值（8.5～10.5）、增加H2O2浓度。遮光下进行孵育是本法的关键。

•洗涤: 用冷的磷酸缓冲液充分洗涤。

•后固定：用1％四氧化锇固定60min，使氧化沉淀物变为锇黑。

•对照：样品在含0.5mg／m1过氧化氢酶的无H2O2的DAB介质中孵育，以排除介质中的内源性过氧化物。

表13 碱性DAB- H2O2法显示过氧化氢酶的孵育液成份 预孵育液组成： DAB•4HCl盐 双蒸水 0.05M 2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇 100mg 1.0ml 9.0ml 孵育液A配方： 30％H2O2 PBS 1.0ml 29ml 孵育液B配方： DAB•4HCl盐 双蒸水 0.1M 2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇 30％ H2O2 0.1M NaOH 30mg 12ml 15ml 1.0ml 2.1ml

• 胆碱乙酰转移酶(ChAc)

电镜下显示ChAc可用铁氰化物还原法。乙酰辅酶A（Acetyl－CoA）失去乙酰基变成CoA－SH后，高铁氰化物被还原，变成亚铁氰化物，这种亚铁氰化物捕捉重金属（如钴），在酶的活性部位沉淀。脑神经细胞的细胞膜、线粒体膜、高尔基体、内质网、突触间隙和突触小泡均可发现酶的活性。

•固定：固定液有两种，配方见表14和表15。胆碱乙酰转移酶的活性很容易被戊二醛破坏而失活。此外，为了保护底物，也有在固定液1中加入乙酰辅酶A 60mmol/L，氯化胆碱5mmol/L。固定液2主要用于后固定中使用，使用时，将A，B，C三种溶液按以下比例混合：2ml A液＋2ml B液＋5ml C液＋0.45g蔗糖，最后加蒸馏水至10ml。一般在固定液1中，4℃固定10～30min，组织化学产物反应仍比较弱，则可将样品先在孵育液中反应15～20min，再直接将样品加入固定液2中进行固定，酶活性会清楚显示出来。

•孵育：孵育液配方配方见表 。加双蒸水至总量为10ml。pH6.8，室温孵育30～60min。

•洗涤：用含10％蔗糖的100mmol/L磷酸缓冲液在4℃充分洗涤1h，期间换液数次。

•后固定主要用固定液2，4℃固定30～60min。

•对照：可将孵育液中的底物(乙酰辅酶A)和氯化胆碱取消后进行反应，孵育样品。此外，液可在反应液中加入SH基抑制剂3mmol/LN－乙基－顺丁烯二酰亚胺或碘醋酸钠，或加入胆碱乙酰转移酶的抑制剂40mmol/L氯化四甲铵或1～10mmol/L N－羟乙基－4－（1－萘乙烯）溴化吡啶。添加抑制剂时，孵育液的pH值一定要调整。

表14 铁氰化物还原法显示胆碱乙酰转移酶固定液成份 固定液1 多聚甲醛 蒸馏水 1M NaOH 4.0g 40ml 4滴 60℃以下加热溶解后，水浴冷却 200mM磷酸缓冲液 蔗糖 1％CaCl2 50ml 4.0g 10滴 混合溶解过滤后，加蒸馏水至100ml，调整至pH7.2。 固定液 2，A液： 巴比妥钠 醋酸钠 蒸馏水溶解并加至总量为： 14.7g 9.7g 500ml

         B液：	35％ HCl

或10％HCl 加蒸馏水至 1.0ml 4.0ml 100ml

          C液：	2％锇酸

表15 铁氰化物还原法显示胆碱乙酰转移酶孵育液成份 100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0） 乙酰辅酶A 100mmol/L氯化胆碱 100mmol/L柠檬酸钠 30mmol/L氯化钴 5mm0l/L高铁氰化钾 Tetraisopropyrophosphoramide 蔗糖 6.0ml 5.0mg 1.0ml 0.3ml 1.0ml 1.0ml 3.4mg 1.5g

糖类的电镜细胞化学

• 多糖

电镜细胞化学常用高碘酸－硫卡巴肼－蛋白银（PA－TCH－SP）法显示HCl。这方法用含有强还原基的硫卡巴肼（thiocar-bohydrazide,TCH），为使反应可视化，还需蛋白银（Protein Silver）还原以获得高电子密度的反应产物。

•固定：尽量使用醛类固定剂。

•常规包埋切片。

•孵育：所需器具和溶液，镊网或金网（不用铜网），1％过碘酸水溶液，1％～2％ TCH－20％醋酸溶液（1～2g硫卡巴肼（TCH），100ml的20％醋酸，使用时将硫卡巴肼溶于20％醋酸，溶解后过滤。），5％、10％、20％醋酸溶液，1％蛋白银水溶液。孵育步骤： ◇预孵育：将切片在1％过碘酸溶液中浸泡30min； ◇双蒸水洗涤； ◇孵育：1％～2％ TCH溶液浸泡孵育60min； ◇洗涤：10％醋酸洗涤数次后再换5％醋酸洗涤，然后再用双蒸水洗涤数次； ◇显色：1％蛋白银浸泡60min，期间不断振动； ◇双蒸水洗涤，干燥后观察。可以看到邻位羟基处出现高电子密度的反应产物。

注意事项：进行蛋白银染时，容器需用铝箔彻底遮光，容器可选用小型样品瓶。TCH可用氨基硫脲（thiosemicarbazide）代替。

• 复合糖

• • 透析铁染色法

以复合糖类醛基作为反应基础，复合糖类的负电基团与胶体铁反应，形成具有高电子密度的复合物。

透析铁溶液的制备：将75g的三氯化铁细颗粒溶于250ml双蒸水，再加入100ml甘油，然后边搅拌边滴加55ml的28％强氨水。将溶液注入透析袋，用双蒸水透析3d。透析铁原液和冰 醋酸以4：1混合。

•将组织在2％戊二醛固定，固定后可用0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4），4℃漂洗2h以上或过夜。

•厚切片：将组织用8％蔗糖水洗，振荡切片机或恒温冷箱切片机切片40m；

•孵育：切片加入透析铁溶液，室温孵育18h；

•8％蔗糖水充分洗涤；

•后固定：1％锇酸4℃固定1h；

•常规超薄切片样品制备

•染色：用1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤干燥后观察。染色结果：在酸性基处出现高电子密度的透析铁沉淀。

• • 高铁二胺染色法

高铁二胺能与硫酸基特异性反应，因此含有硫酸基的复合糖类可通过与高铁二胺起反应进行电镜细胞化学鉴定。

高铁二胺液的制备：将120mg的N－二甲基－间－苯二胺－二盐酸和20mg的N，N－二甲基－对－苯二胺－盐酸共溶于50ml双蒸水，再加入40％三氯化铁－5％盐酸溶液1.6ml，充分混合。

•固定：用2％戊二醛常规固定后，用0.1mmol/L二钾砷酸钠（pH7.4），4℃漂洗2h以上或过夜。

•组织进行厚切片40m。

•用0.1mmol/L二钾砷酸钠缓冲液（pH7.4）充分洗涤。

•孵育：将样品浸泡在高铁二胺溶液中，4℃，18～24h，而后用缓冲液充分洗涤。

•后固定：4℃、1％锇酸固定1h。

•常规脱水、树脂包埋，超薄切片，1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤，干燥后，电镜观察。含有硫酸基的复合多糖类存在的地方将出现循环沉淀产物。

注：超薄切片若分别置于1％～2％ TCH溶液和1％蛋白银水溶液浸泡于60min，则效果更佳。

脂类的电镜组织化学

细胞中所含的脂类除了富含磷脂的膜成分和以中性脂肪为主的脂滴外还存在着形态和机能上位于膜和脂滴中间的膜结构即吞噬脂类的细胞器。通过分析这些脂类的存在的位置及其形态结构结合生化分析可以了解高尔基体、内质网、溶酶体等细胞器为中心的脂质代谢的动态变化过程。对含脂类组织进行电镜细胞化学分析时常将具有脂类的组织或组分通过离心等方法将其进行分离。

•将脂类组分用磷酸缓冲液稀释至浓度大约为100mmol/L，然后加4％锇酸固定液5滴进行混合固定。约2min后，35000rpm超速离心30min，取沉淀块，并用8.5%蔗糖水洗涤（静止放置10min）。

•12.5%戊二醛固定15min。

•8.5%蔗糖洗涤静放30min。

•5％蔗糖－0.5M醋酸铀进行块染15min（避光）。

•8.5%蔗糖洗涤后进行常规脱水。

•用QuetolMixturebaom聚合包埋。

•超薄切片后进行铅染色，电镜下观察。

DNA的电镜组织化学

电镜水平上特异性显示DNA的技术利用锇的氨络合物作为反差试剂，锇的氨络合物染色方法已经用于冷冻切片及Epon或Lowicryl包埋的切片，但此法的缺陷是锇－氨络合物不稳定。Olins等人对该法进行了改进，使形成的锇－氨络合物更稳定。另外一种简单的方法是利用低pH值下的磷钨酸（PTA）。该方法具有简单、便宜、快速和反差强的特点。但该法的特异性不高，样品必须用乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）包埋，GMA是一种难以切片的包埋树脂。后一种缺陷可以通过块染，然后再用环氧树脂包埋的方法克服。利用此法，已经在电镜水平上通过染色质的一些列切片得到了染色质的三维结构分布。该方法也能与特异性抗原的免疫标记方法在同一切片上共同使用。

• 利用PTA方法对染色质染色

PTA配制：将3g PTA溶解于100ml 1mol/L的盐酸中，使用时取10～20ml，用1mol/L的NaOH调节pH值到2.1～2.5，即可使用。单层培养细胞或用LR White包埋的样品，建议pH值选用2.84。

•固定：用带有醛的固定液进行常规固定，不能使用锇酸固定。

•若用EPON等环氧树脂包埋，则用3％的PTA进行块染。

•脱水切片等步骤按常规进行。

•若用GMA包埋的材料制成的切片的载网，则在室温条件下孵育于3％的PTA上30～60min；

•双蒸水冲洗，空气干燥。

• DNA的锇－氨络合物染色

该技术对于醛固定的样品非常有效，但不适合于锇酸后固定的样品。切片必须不依赖支持膜而是直接放于金载网上。

醋酸染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于2.6ml双蒸水中，完全溶解后，加入2.4ml冰醋酸，然后加入40mg的Na2S2O5到溶液中溶解，使用前用一个密封性能好的塞子塞住30min。配好的溶液可以在同一试管中保存几周。

HCl染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于4.8ml双蒸水中。完全溶解后，加入0.2ml的5mol/L的HCl溶液，然后加入40mg的Na2S2O5到溶液中溶解，配好的溶液可以在同一试管中保存几周。

•室温下将装有薄切片的未包被的金载网漂浮于5mol/L的HCl溶液上，室温下30min。

•用双蒸水小心冲洗几次。

•染色切片：室温下将载网浸入锇氨络合物－B的醋酸染色液或锇氨络合物－B盐酸染色液中，30～120min。有时要求在37℃染色1h。

•小心用双蒸水冲洗切片若干次，空气中干燥，用透射电镜观察。