绪论
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绪论
申请报告
--大鸟
透射电子显微镜是进行生命科学研究不可缺少的重要工具，仅在生科院，2005年下半年就有20名教授的科研课题使用了电镜设备。因此，加强透射电镜操作及相关生物样品制备的实验基础教育十分必要，使科研人员熟悉电镜中的微观现象对提高研究水平大有裨益。由于电镜设备的精密性和复杂性，很难进行多人的现场实验教学，所以建设电镜实验教学的网络课程是解决电镜实验教学中“设备少，流程繁，周期长，人员多”矛盾的最佳方案，是提高服务质量和科研水平的有力保障，网络课程发挥了多媒体的优势，加强了图片和视频的直观教学作用，弥补了纸质教材的不足。我们在多年的教学实践、科研服务和本专业教材修订的基础上提出这一网络课程建设的申请。
本网络课程以新修订的《现代生物电子显微学方法》（张景强，2006，送审，41万字）为蓝本，编写相应的实验教材。本实验教材精选了电镜操作和生物样品制备中最常用和最典型的实验案例，总为十章：绪论、透射电镜结构与操作、常规超薄切片、冷冻超薄切片、细胞化学与免疫电镜、负染色与病毒形态学研究、冷冻电镜与病毒的单颗粒技术研究、扫描电镜的结构与操作、扫描电镜样品制备。该课程完全面向实际应用，深入浅出的介绍在生物超微结构研究中最常用的和最前沿的实验技术，一方面可以让来电镜室进行电镜观察的师生了解基本的实验要求，另一方面可以通过培训提高师生的电镜自操作能力。本网络课程的设计参考了化工学院的“现代化学实验与技术”网络课程的优点，着重于建设具有交互性操作功能的网络虚拟实验。
“现代生物电子显微方法”前言
--张景强
注:“现代生物电子显微方法”因内容过于庞杂，被分解为两本书“生命科学中的电子显微学技术（教材）”和“病毒的电子显微学研究（专著）”，随着本网络教材的编写和教学反馈，后面还预计合作出版两本书“生物电子显微学实验教程”和“病毒结构生物学实验教程”
--李鲲鹏
人类通过了解自然，改造自然为自身服务。要了解自然，人类通过眼、耳、口、鼻和皮肤等感知自然界。其中最重要的是眼，所谓“眼见为实”。然而眼的能力有限，一般人眼能辨别的最小尺寸不小于0.1mm，更小的就看不见了。由于对微观世界的了解对于人类改造自然，造福自己具有特别重要的意义。因此，为了扩大眼的观察范围，人类想了许多办法。光学显微镜的出现，对于生物学、医学的发展做出巨大的贡献。以致数十年前大多数的生 物学、医学的书籍多用光学显微镜图作为书的封面。
- 电子显微镜的出现
但随着社会和科学的发展，人类要求更深入了解微观世界，光学显微镜就不能满足要求了，例如多数的细胞器看不清，对人类的健康和生命产生重要危害的病毒基本上看不到等等。为了看清更小的结构，就增加了光学显微镜的 放大倍数。然而增加到某放大倍数后再增加些，得到的却是更大的但变模糊的像，更小的东西仍然看不到。分析原因是由于光的衍射现象造成的。当我们要观察的物体的大小与所使用的照明光的波长相当时，由于光的衍射现象，每个点光源通过透镜所成的像不是一个点而是一个同心光环组成的光斑——衍射斑。由有一定大小的光斑组成的像当然变得模糊了。这样就限制了光学显微镜的分辨率，大约为所使用的照明光源波长的一半（1/2λ）。为了提高分辨率，使用波长更短的紫外光作照明，但提高很少。X射线波长非常短，可达到0.1nm，但至今为止仍未找到一种物质能使X射线偏转的。因此也无法制造X射线的会聚透镜，也就无法使用X射线进行放大成像。
20世纪初，量子力学出现了，它表明高速运动的电子束也是一种波。如果在100kV下加速电子束，它的波长为λ≈0.004nm。与此同时Maxswell电磁理论指出：轴对称的磁场会使电子束会聚。这样轴对称磁场就成了电子束的会聚透镜---磁透镜。有了波长极短的照明波，又有了能使它会聚的磁透镜，就为电子显微镜的出现奠定了基础。1932年德国科学家Knoll和他的学生Ruska在这个基础上发明了电子显微镜。它从原理到结构都与光学显微镜相似，只是用电子束代替光束，磁透镜代替玻璃透镜。
经过了半个多世纪的发展，电子显微镜变得更完善，分辨率更高，相关技术、方法特别是样品制备技术也成熟了，使得电子显微技术在自然科学几乎所有学科中发挥巨大作用，取得许多突破性的发展。为了表彰其发明者的贡献，Ruska获得了1986年诺贝尔奖。一个新的学科，电子显微学出现了。
- 形态学的应用
电子显微镜在生命科学的应用最早是在病毒的观察研究上。由于没有相应的样品制备技术，所观察到的病毒像并不清晰，但还是直接观察到病毒了。然而，电子显微镜在生命学科的应用常常落后于其他学科。这主要是由于生物样品的制备和观察存在特殊困难：首先是电子显微镜内是高真空的，而生物材料含有大量的水份，会因水份在真空中挥发而变形；其次，生物样品大多数由碳、氢、氧和氮等轻元素组成，对电子的散射较弱，尤其是相互之间的差别更小，使图像反差很弱，噪音大；其三，电子显微镜的电子束穿透能力弱，因此要求样品很薄（厚度小于100nm），而生物材料强度低，难以切成如此薄的切片；最后，生物材料比较脆弱、其碳键只有10eV能量，而电子显微镜用的是高能电子束，因此，生物样品极易受到电子束损伤等等。
电子显微镜在生命科学的应用中，最重要的样品制备法是超薄切片技术，它是由Newman于1949年发明的（在此之前美国一位科学家使用极锋利的刀片，斜削生物材料如植物根尖，这些在尖端处样品就很薄，就用这样方法制备电子显微镜生物样品的）。超薄切片技术是在光学显微镜石蜡切片的基础上发展起来的。Newman用有机玻璃取代石蜡，因为有机玻璃有较好机械性能，使它能切出约$5～60nm的超薄片，而且能承受高能电子束的轰击；其次固定液用四氧化锇（OsO_4）取代福尔马林，因为电子显微镜有较高分辨率能观察到更微细的结构，就要求固定液能保持生物微细结构，四氧化锇能做到，而福尔马林则不行；最后用精密的热膨胀推进取代较粗的机械推进，用更锋利的玻璃刀取代金属刀。结果切出50～60nm超薄切片。超薄切片法的出现极大地推动电子显微镜在生命科学中的应用，大大促进了细胞学（几乎所有亚细胞结构的信息是由它提供）、组织学、病理学、病毒学等发展，并由此而产生电子显微镜诊断学。经过不断的改进，超薄切片法制备样品，大约可获得2nm的分辨率。
另一个重要的样品制备技术是负染色方法。首先是Hall在1955年提出来的。他用磷钨酸染色病毒样品后，用电镜观察发现图像背景很暗，而病毒较亮被清晰地显示出来，像通常的负片一样，故称负染色。负染色的方法简单、快速，可以显示生物大分子、病毒、细菌及分离的细胞器等，一直至今它仍然被广泛应用。病毒学的大多数的形态学资料是由负染色的方法提供的。
- 形态与功能的结合
上述两种方法给予电子显微镜在生命科学广泛的应用空间，取得许多重要科学成果。不过基本上是属于形态学的研究。然而人们不单要了解这些生物物质的形态结构，更希望了解它们的功能，上述的方法也可以了解一些生物物质的功能，但多数是依赖推测或推论，而不是实验依据。结合功能的研究方法主要有：电镜细胞化学技术，免疫电镜技术以及电镜原位杂交技术等。这些技术基本上是由相关的光学显微镜技术发展起来的。电镜细胞化学技术是利用特异的化学或生化反应在电镜下对细胞的成分进行定性的与定位分析的方法。免疫电镜技术是利用抗原和抗体的特异反应在电镜下对抗原进行定位和定量分析的技术。它们的基本特征是：在基本上保持细胞自然状况的结构的条件下，研究细胞结构的某些化学成分的分布和含量，进而说明它们在细胞中的作用。
此外，还有一个十分重要的技术---冷冻电镜技术。上述的技术都需要经过样品固定、脱水，还有包埋等化学或物理的处理过程。这些过程都可能使生物样品的成分和超微结构发生变化，从而造成人工假象或结构、成分的掉失。冷冻技术是用速冻的方法使样品以每秒下降10^3～10^4℃的速度冷冻，在极短的时间内水变成非晶态的固体（没有冰晶产生就不会损伤样品），就能保持生物物质处于非常接近自然状态。它不仅具有客观真实性，还是保持酶的活性，对功能研究很有利。冷冻技术包括：冷冻蚀刻、冷冻超薄切片和冷冻置换等技术。
- 生物大分子的结构研究
如上所述，经过半个多世纪的发展，电镜在生命科学的应用，出现了一系列的新方法和新技术，取得了许多重大的科学成果。但存在两个明显的缺陷：只获得直接观察到的信息（未进行图像信息处理），不能直接观察到信息没有被充分利用，相对于电镜本身的分辨率而言（大约0.2nm）生物材料分辨率很低（>1.5nm）。最早把图像信息处理方法引进生物电子显微学中的是A.Klug，他原来从事应用X射线晶体学研究生物大分子结构，因此他熟悉数据处理方法。后来转到生物电镜的研究，于是他把自己熟悉的图像信息处理的思想和方法引入电镜图像中去。在蛋白质和病毒的电镜研究中，由于方法有了突破，能够利用过去无法使用的，而又非常有用的信息，从而获得许多杰出的科研成果。A.Klug获得了1982年的诺贝尔奖。在授奖仪式上，瑞典科学院院长说：A.Klug博士的贡献在于他从一无所有的照片中获得生物大分子的结构。
A.Klug和他的助手们开始时样品制备仍然沿用负染色方法，但对所得的图像进行计算机处理，虽然获得了更多结构信息，但发现负染色的方法存在严重缺陷：首先分辨率受负染色剂颗粒性（直径>0.7nm）的影响，最高的分辨率在1.5nm以上。其次负染色方法只能获得外表形貌，无法获得内部结构信息。最后由于负染色样较厚（>,200nm），无法使用高分辨率的相位反差成像机制。为了克服这些不足A.Klug在制备样品时尽量保持样品处于自然状态，同时采取一些必要措施改善样品由于没有负染色剂保护所发生的问题：首先负染色时，所观察到的象实际上是样品的负染色剂的复型象，高能电子作用于负染色剂。不染色时，生物样品不能承受高能电子束作用而损伤。A.Klug他们采用低剂量电子束技术，电子束流在1～2\,e^-/{\AA}^2\cdot\,S$,从而减少电子束的辐射损伤。其次含水的生物样品在电镜的高真空下水份挥发而使样品结构严重改变。A.Klug等人用物理与化学特性与水相近而不会在真空中挥发的物质如：葡萄糖、单宁酸等取代样品中的水份，样品因而保持自然状态，又不受电镜真空的损伤。在这种情况下，当样品足够薄时（<200nm）时，就可以使用高分辨率的相位反差成像机制了，从而获得高分辨率。然而即使采用了这些措施，单个生物大分子像仍无法获得。原因是由于生物大分子主要由碳、氢、氧和氮等轻元素组成，不作染色所得图像反差很弱，更由于为了防止电子束损伤而采用低剂量技术，使获得的图像统计噪音远大于图像信号，图像极差，无法辨别图内结构。为此，只能采用叠加法获得平均象，当叠加数为N时，图像信噪比将增加$\sqrt{N}倍，而这样获得的象就是一个平均象。如果研究对象是排列规则的蛋白质晶体的话，就可以用电子衍射方法进行叠加。这样就形成了蛋白质电子晶体学（ElectronCrystallography）方法。这种方法由于对样品的要求是极小的薄晶，技术上比较容易获得，因此补充X射线晶体学方法，特别有利于膜蛋白的结构研究。其中最成功的例子是植物捕光复合物II(Light-HarvestingComplex II,LHC-II）的结构研究，获0.34nm的分辨率。除氢原子外，还可以进行原子定位，其作者Khlhrand W.等获诺贝尔奖提名。
对于像病毒、离子通道和核糖体等颗粒状的生物大分子复合体，上述方法就不适用了。不过在方法上作一些变动就可用于上述单颗粒状的生物大分子复合体：首先像病毒等生物材料不能用葡萄糖或单宁酸等取代水份而防止真空损伤，而采用冷冻技术---让带有病毒的水膜急速冷冻至-160℃左右，形成非晶体固体膜，使病毒处于自然状态，并能起防止真空损伤和电子束辐射损伤的作用。其次单颗粒材料不能用衍射方法叠加，而采用计算机方法叠加。这就形成了单颗粒技术（Single Particle Analysis）或称冷冻电镜计算机三维重构技术。1977年，《Nature》杂志发表了B.ttcher关于应用冷冻电镜计算机三维重构技术研究乙肝病毒三维结构论文，分辨率为0.74nm，引起国际学术界的强烈反应。著名科学家D.J.DeRosier在该期Nature杂志中，发表题为“谁还需要晶体”的文章，指出：“这是一个大进步，它使分子生物学家不用结晶就可以获得大分子及其衍生物的结构的梦想变成现实”。我国两院院士把这成果评为1977年世界十大科技进展之一，并认为：“这一成果可以帮助科学家从分子角度研究乙肝的致病机理，从而为研制乙肝疫苗和药物奠定了基础。”
此外，具有明显的功能作用的细胞器或其他细胞内微细结构的三维结构分析对于生物学家、医学家也是十分感兴趣的。因为往往与疾病联系在一起的。对于他们的三维结构研究一直不断在进行。这些结构特点是单一结构，不存在全同性，因此不能用叠加的方法提高信噪比。三维结构也用倾斜方法获得，因而分辨率较低。最近电镜计算机控制倾斜台的出现使这些研究获得飞跃的发展，形成一种新技术称电子断层成像技术（Electron Tomography）。
从上所述可见，经过半个多世纪发展和几代科学家的努力，透射电子显微镜在生命科学的应用方法和技术获得巨大的进展，也取得令人瞩目的科学成就。它能够研究的范围从细胞到大分子复合物，直至大分子结构；从两维的平面结构到三维的空间结构；并且能从结构研究到功能研究。它在生物大分子研究领域的作用超过十九世纪光学显微镜在生命科学中的作用。与此同时，一个新的学科---生物电子显微学也形成了，成为结构生物学中的一个重要分支
- 其它的显微镜
除透射电子显微镜外，1965年出现了扫描电子显微镜，它能在很大的放大率变化范围内观察生物物质的表面形貌，而且立体感强，同时又可对生物样品进行微区成分分析。此外，在1981年出现了扫描隧道显微镜，以后逐渐发展成为一系列扫描探针显微镜。这些显微镜具有明显的特色：结构简单，具有极高分辨率（0.01nm）和极高放大倍数，样品可处于真空、气体或液体中，并且没有高能电子作用于样品上。因此对于生物材料研究非常有利，其中特别是原子力显微镜（AFM）和近场光学显微镜。他们不但能观察生命物质，而且还能进行操纵和加工等。成为纳米生物学的重要设备。
作者和他的同事在上个世纪80年代初就在生物学学生中开设“生物电子显微技术”课程，一直持续到现在。并且在1987年与第一军医大学朴英杰教授等人合作编写出版了《生物电子显微技术》（中山大学出版社1987.1）一书作为教材。当时有近30所高校生命科学的院系把它作为教材或重要参考书。1991年根据学科发展和教学需要，在第一版的基础上做了较大修改而出版了第二版（中山大学出版社1991.5）。至今，十多年过去了，我国高校教学和科研事业都上了一个新台阶，生物电子显微学本身更迅速发展。我们自己的研究工作也上了一个新台阶。因此，我们决定重新编写一本教材，定名为《现代生物电子显微学方法》。书名的改变表明教材新的版本与过去的版本有了根本性的变化。主要表现在：在体系上，我们把生物电子显微学的方法分成三个部分：即形态学的研究方法；结合生物功能的研究方法；生物大分子电子显微学方法和图象采集与数字处理方法。A.Klug把图象信息计算机处理技术引进到电子显微镜的图象处理中，使生物电子显微学上了一个新台阶。所以我们对这方面的方法做了较详细的介绍，而对一些传统的但使用较少的方法，我们也做了适当的删节，比如：放射性自显影技术，冷冻刻蚀技术等。这样的改进使得本教材在保持原有的实用特色的同时，更能反映出电子显微学的新的进展。
本教材的作者多数是年轻人，希望可以更好的反映这门课新的面貌，更适应国家教育的发展和学科的发展。
“生命科学中的电子显微技术”的前言
人类通过了解自然，改造自然为自身服务。要了解自然，人类是通过眼、耳、口、鼻和皮肤等感知自然界。其中最重要的是眼，所谓“眼见为实”。但人眼的能力有限，一般人眼能辨别的最小细节不小于0.1mm，更小的细节就看不见了。然而对微观世界的了解于人类改造自然，造福自己具有特别重要的作用。因此，为了扩大人眼的观察范围，人类付出了巨大的努力，光学显微镜的发明就是其中之一。光学显微镜对整个生命科学的发展作出异常巨大的贡献。以致在数十年前，大多数的生物学、医学或农学的书籍多用光学显微镜作为书的封面。
但随着科学的进步人们需要更深入地了解微观世界，却发现光学显微镜远不能满足要求，例如多数的细胞器看不清，对人类严重危害的病毒基本上看不见等等。于是人们开始寻找能够观察更小细节的显微装置，1932年德国科学家Ruska发明了电子显微镜。它从原理到结构都与光学显微镜相似，只是用电子束代替光束作照明，用磁透镜代替玻璃透镜。然而，它却能分辨0.1nm的细节，与人眼能力相差一百万倍。经过数十年的发展，电子显微镜变得更完善、分辨本领更高；相关技术、方法特别是样品制备和计算机图象处理技术也成熟了。从而使得电子显微镜在整个自然科学几乎所有的学科中都发挥了巨大的作用，取得许多突破性的发展,Ruska教授因而获得了1986年诺贝尔奖。与此同时，一个新的学科——电子显微学产生了。在生命科学中也取得触目的成果，尤其在细胞学，组织学，病毒学,病理学等学科中成为不可替代的手段。在生物大分子的结构和功能的研究中，与X光晶体学，核磁共振等构成结构生物学中的三大研究手段。因此，生命科学的学生和工作者需要掌握这门技术。
作者认为对于从事生命科学研究的学生和工作者,学习电子显微技术应掌握以下三方面：一，是电子显微镜的一般操作以及基本工作原理。二，是样品制备,由于生物材料是有生命的物体，柔软含水和易受环境损伤等原因，造成生物样品的制备是所有样品中最复杂，最困难的，因而是学习的重点。三，是对所获的图象理解和分析，这是研究工作的目标和研究者水平的重要体现，也要有个基本了解。作者在上世纪80年代就在生物系学生中开设“生物电子显微技术”课程，一直持续到现在。并且与南方医科大学朴英杰教授等人合作编写出版了“生物电子显微技术”《中山大学出版社1987.1》一书作为教材。该书(曾获中山大学优秀教材奨)很快售完，于是在第一版的基础上做了较大的修改而出版了第二版“生物电子显微技术”《中山大学出版社1993.5》。至今十多年过去了，我国高校的教学与科研都发生了极大变化，电子显微技术本身发展尤为迅速。因此，我们决定重新编写一本新教材，定名为“生命科学中的电子显微技术”。书名的改变表明新教材与过去的教材有很大的变化。主要表现在：1加强了实用性：在内容上把一些传统的但却很少使用的技术如电镜放射自显影技术、冷冻蚀刻技术等作了删节，同时增加一些很实用的内容如：应用电镜负染色技术研究病毒形态和结构以及细胞电镜图象分析等，在其他章节的介绍中也注意实用性；2先进性：当前生物电子显微技术的最重要的发展是冷冻技术和生物大分子电子显微技术。它们能达到既保持生物样品在自然的状态又能获得前所未有的高分辨率。本书对这些新发展作了简明扼要、深入浅出的介绍。而其他常用技术也以当前的观点和水平来介绍。我们希望本书能达到既实用又能反映生物电子显微学的新发展。能帮助学生通过学习掌握上面提到的三个方面的知识。
网络教程前言
通过近3年的教学实践，生物电子显微技术作为一门实验技术，实在是不适合于课堂讲授的，但是电镜设备只有一台，精密贵重，操作复杂，也不适合于很多人集中实验练习。我一共参予了两年的“生物电子显微镜技术”的课堂教学，但是一到具体的操作的时候，课堂讲授的知识起不到任何帮助，过了一年之后，大家对于理论性的知识也几乎留不下什么印象，这实在让人沮丧。结合自己掌握电镜技术的过程：跟老师学习操作，在研究和值班过程中不断的练习，碰到需要理论解释的问题再去查资料。这让我认识到：实验技术的教学一定有些不同于理论教学的内在规律和教学方法需要我们去探索。因此，我在新学年的第一个学期开始尝试新的电镜实验教学方法：编写网络教程->学生自学基础理论知识（4周）->通过测试和答疑把握学习进度->生物样品制备和超薄切片的培训和定期练习（4周）->电镜自操作培训和定期练习（4周）->参予电镜室值班服务工作（4周）。
这种教学方法的把“学生动手做”放在首要的位置，但是先讲规矩和理论，这样学生可以在实践活动中把规则固化为习惯，并通过实践来理解理论，学生进行长达12周的练习和参予实际的工作，可以把学生置于一个紧凑的高频率的操作练习环境中进行操作强化，最终可以实现掌握电镜操作技能的目的。此外，还每月开设“自操作短训班”，要求所有使用电镜的用户都要提前参加这个“短训班”，通过这个短训告知用户设备安全操作守则和操作注意事项，让用户对电镜室规则、生物样品的处理过程、生物样品在电镜下的成像特点和如何获得好的电镜图像等问题有所了解。经过"自操作"培训的人员可以独立完成大部分生物样品制备和电镜观测工作，而且容易出现误操作的关键操作环节都被隔离开来，在提高电镜使用效率和研究质量的同时又降低了设备操作失当的风险。经过八周技能培训的选课学生承担了每周一次的“短训班”的培训任务，这又是练习和值班之外第三轮技能强化训练。
新的教学方法在这一个学期收到了良好的效果：选修本课程的学生通过一个学期的培训基本掌握了生物电子显微实验技能的主要部分，当然，要成为一个熟练的超薄切片高手和电镜操作高手，还需要长时间的艰苦练习。
这本实验教材的编写体例也体现了教学方法的变化，更加注重可操作性和介绍实验操作中可能碰到的问题和注意事项，同时作为一本教材也适当考虑了必要的理论性说明，当您需要寻找更根本的解释时，建议您参考本实验室的另外两本书“生命科学中的电子显微技术”和“病毒的电子显微学研究”。
由于本书是一本网络教材，因此其版本是随着研究范围和研究深度的变化而变化的，其网络版随时会有一些调整或者增加的内容，当调整内容和新增内容超过原书三分之一的内容的时候，就会推出新的纸质版本。当然，网络版是可以通过网络共同创作的，她现在就是很多人共同创作的结果，因此她是鲜活的且无偿的共享给读者，同时希望读者不吝提出意见或建议，更期待您直接参予网络版的编写。
如何学习本教程
首先建议您全面了解本实验教材的基本理论部分，这些基本理论都是为生物系学生量身定造的，去除了大部分的数理推导，而做了许多类比说明，易于理解和掌握。
其次建议您认真使用本网络教材所提供的视频和虚拟实验，珍惜每一次上机实习，按照本实验教材的基本实验要求认真练习，以求掌握最基本的实验技术。
最后建议您了解一些较为前沿的实验技术，虽然不是必须的，但是对于高级课题的研究是有益的。
well done