负染色技术与病毒研究
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负染色技术
负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。负染色首先由Hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色。对于负染色的机制目前还不十分了解。对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
负染色液的制备
用作负染色的负染色剂应具有：
- 较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；
- 熔点高，在电子束的轰击下不会升华；
- 溶解度大，不易析出沉淀；
- 在电镜下不呈现出可观察到的结构；
- 分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；
- 与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：
- 磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
- 醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
- 甲酸铀：用双蒸水配制成0.5％～1％水溶液，pH值为3.5，使用时用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5～5.2。
- 钼酸铵：用双蒸水配制成2％～3％水溶液，使用时用醋酸铵将pH值调至7.0～7.4。钼酸铵对有界膜的生物材料具有特别良好的染色值。
染色方法
- 悬滴法
用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作。如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。干燥时，由于表面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二醛或四氧化锇预固定。预固定在滴样之后进行。
- 喷雾法
将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用。
- 漂浮法
先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。
操作中的注意事项
一个理想的负染样品的图像应是均匀的，在一万倍的放大倍率下，图像出现一些薄薄的染色斑块，其特点是没有明显的边缘，染色斑由中央向边缘由深到浅，有一个逐渐变化的过程，如同中国水墨画的润色一样。在3～4万倍观察时则可见到反差良好而柔和的生物结构。而与此相反，黑白截然分明，缺乏由浅到深的中间色调，或在明亮的载网上出现颗粒性团块，则是染色失败的表现。因此，虽然负染色方法简单，但要获得理想的负染色效果和实验的重复性却不大容易。下列因素在操作中需加以注意：
- 悬液样品的纯度
待染色的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不要有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯。
- 悬液样品的浓度
样品悬液的浓度要适中，否则太稀时在电镜下寻找样品将很困难；太浓时，样品的堆集会影响观察。因此第一次制样时，同时用几种浓度的样品进行滴样，从而采用浓度适中的铜网进行观察。一般负染色技术通常要求每份样品至少含有10^7/ml目标颗粒，才能被观察到。
- 样品和染色液的均匀分布问题
生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜。使用其它支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不容易拍摄到好的照片。但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集，在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节。为了提高染色效果，需要设法促进样品和染料的均匀分散，可采用以下方法：
- {使用分散剂} 常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液。方法是把0.005％～0.05％牛血清蛋白溶液加到样品悬液内，所加量无严格的规定，先加数滴，如果仍不见效可适当增加；也可以直接用0.01％BSA作为离心沉淀物的稀释液。此外，也可以用杆菌肽，按30～50μg／ml的浓度用蒸馏水配制成溶液，用作沉淀物的稀释液。或将样品悬液，PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样。
- {亲水性处理} 对碳膜进行亲水性处理方法如下：把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa～1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性。用这种碳膜就不存在样品与染色剂凝集的问题。但要注意碳膜经亲水性处理后，经过1～2天又会变为疏水性的，因此最好亲水性处理后立即使用。
- 样品悬液和染色液的酸碱度问题
样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响。为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2％醋酸铵或硫酸铵作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜。
染色液的酸碱度不仅影响到染色液的扩散，而且会对病毒的形态造成一定影响。负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果。某些负染色剂及其pH的参考值见表：
| 负染色剂 | 浓度（％） | pH值 | 缓冲液 |
|---|---|---|---|
| 磷钨酸钾 | 2 | 6.0~7.0 | 醋酸铵 |
| 醋酸铀 | 0.1~1 | 4.0~5.2 | 无 |
| 甲酸铀 | 0.5~1 | 4.0~5.2 | 无 |
| 钼酸铵 | 2~3 | 6.0~8.0 | 醋酸铵 |
| 钨酸锂 | 2 | 6.0~7.5 | 醋酸铵 |
| 硼酸钨钠 | 2 | 5.5~7.0 | 无 |
不同的样品要求不同的pH值，因此，在具体应用时，不要生搬硬套，而应当做必要的摸索。
染色的时机
染色的时机十分重要。滴染色液的时机一般既不要在生物样品完全干了之后，更不应在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色。恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液。如果载网上尚有悬液残存时就进行染色，或者完全干后再染色，效果都不佳。
负染色引起的缺陷
负染色的应用，尤其有助于用电镜研究小的、游离的悬浮物，如病毒，细胞器，如叶绿体，线粒体等。负染色方法染色本身，染色液的溶剂、离子组成、亲水性、pH值和干燥情况的变化都可引起缺陷。一种比较常见的缺陷是表现为白色的小球（图\ref{Fig-Negtive-Flaw}）。在进行病毒形态鉴定观察分析时，这种小泡的存在很容易误导，尤其很容易被当作球状病毒。一般样品中的悬浮介质或染色液的pH值偏低时比较容易导致这种缺陷发生。
样品的亲水性，也很容易形成负染色缺陷。当样品亲水性差时，负染色结果经常显示背景差，且样品浓度等得不到真实的显示，引起误解。这时对样品吸附介质，如Fomvar膜进行亲水性的处理，如喷碳、离子蚀刻或采用新鲜制备的铜网等都会改善这种缺陷。
负染色在病毒研究中的应用
早在1892年Dmitri Iranovski就发现烟草花叶病病原的可过滤性之后，病毒就逐渐被人类认识。然而，在此后几乎半个世纪里，人类只是把它看成为一种过滤性的致病因子，对它的认识是非常含糊的。因为病毒太小了，即使应用了高性能的光学显微镜，人们也无法直接观察到，只能通过间接的方法来确认它的存在。1939年，G.A.Kansche首先用电子显微镜观察到烟草花叶病病毒（TMV）。这是人类第一次直接观察到病毒，也是电子显微镜在生命科学最早的重要成果之一。由于电子显微镜的应用，尤其是其后出现的电子显微镜负染色技术和超薄切片技术，使人类对病毒的认识获得了飞跃的发展。从此开创了病毒学研究的新时代。以下我们将结合病毒的形态结构简介负染色在病毒研究中的应用。
电镜下的病毒形态学特征
最初从电子显微镜照片上看到的病毒是一些几乎类似的微粒，1939年，G.A.Kansche首次在电镜下直接观察到了TMV，指出TMV是一种直径为1.5nm，长为300nm的长杆状的颗粒，而番茄黄化花叶病毒（Tomato yellow mosaic virus,TYMV）颗粒为球形，直径为25nm。自此，人们在电镜下观察到许多不同形态和大小病毒粒子。归纳起来电镜下观察病毒形态主要有球状、杆状、丝状、弹状等等。病毒结构可分为三种主要类型：二十面体对称型球状病毒，螺旋对称型杆状病毒和复合对称型病毒。就动物病毒而言，绝大多数动物病毒属于二十面体对称型病毒。螺旋对称型病毒主要是植物病毒，复合对称型病毒则主要是噬菌体。电镜下观察病毒的尺寸差别也很大。完整的病毒颗粒（Virion）直径范围在10nm至400nm。绝大多数病毒无法用光学显微镜观察，只有少数病毒（如痘病毒）可以在光学显微镜下观察到，因为它们和最小的细菌一样大。尽管电镜下病毒的形态大小五花八门，但病毒主要都由核酸和蛋白组成，简单的病毒颗粒由衣壳（Capsid）及其包裹的核酸组成，衣壳是由互相锁定的称为壳粒(Capsomere)的蛋白质组成的一层外壳。衣壳和核酸组成的复合物常被称为核衣壳（Nucleocapsid）。绝大多数衣壳是螺旋型或二十面体型的。病毒的核酸可以是DNA或RNA。在较复杂的病毒中，核衣壳被囊膜（Envelope）包裹，囊膜通常来自宿主细胞的核膜或细胞质膜。病毒基因组编码囊膜蛋白，在病毒组装时插入囊膜。伸出囊膜的蛋白，称为突起（Spike），这些突起常介导病毒吸附到宿主细胞。
病毒的大小
绝大多数病毒必须用电子显微镜才能观察，病毒的大小必须用电镜才能测量。多数单个病毒粒子的直径在100纳米左右，也就是说，把10万个左右的病毒粒子排列起来才可能用眼睛勉强看到。有代表性的病毒的大小见表\ref{table:chap13:VirusSize}：
| 病毒名称 | 直径（nm） | |
|---|---|---|
| 大的病毒 | 虫痘病毒 | 450 |
| 牛痘苗病毒 | 300×250×100 | |
| 长的病毒 | 柑橘衰退病毒 | 2000 |
| 甜菜黄花病毒 | 1250×10 | |
| 铜绿假单胞菌噬菌体 | 1300×10 | |
| 小的病毒 | 口蹄疫病毒 | 21 |
| 乙型肝炎病毒 | 18 | |
| 苜蓿花叶病毒 | 16.5 | |
| 玉米条纹病毒 | 12-8 | |
| 烟草坏死病毒 | 16 | |
| 菜豆畸矮病毒 | 9-11 | |
| 细的病毒 | 大肠杆菌的f1噬菌体 | 5×800 |
值得注意的是，制备病毒样品以及电镜下观察病毒的方法不同，所得到的病毒的大小尺寸会有变化，通常负染色技术所观察到的病毒粒子比较完整。由于该技术的特点，也决定了所得到的病毒粒子的体积会比超薄切片技术所获得的尺寸稍大。而超薄切片技术，由于包埋剂在聚合以及制样过程中由于脱水等原因，所得到的病毒粒子的体积也会稍偏小。此外，在超薄切片过程中，样品会因不同的截面而在形状、大小等方面发生变化，尤其是杆状、丝状或棒状等，所以在电镜下观察病毒粒子的大小，要用几种方法进行观察比较。
病毒的形态
电镜下的病毒形态主要有球状、杆状、丝状、弹状等等。
对于球状或近似球状的病毒来说，无论负染色还是超薄切片或金属投影等技术，电镜下都呈圆形或近似圆形的形态。这些病毒其实都是二十面体或准二十面体对称，电镜下观察到的图像是其三维结构的二维投影。这种形态的病毒粒子圆形颗粒，但仔细观察，病毒粒子大多可看到呈六角形。负染色条件下，完整的粒子电子密度较浅的"白色"圆颗粒（见图\ref{chap13DNV}），仔细观察，这些颗粒表面还会有电子密度不同的区域分布，与染色假象的白色圆颗粒相比，电子密度又稍深。若衣壳内部核酸不存在时，染色液很容易渗透进去，染色显示为一层较浅的蛋白层包裹黑色核心（图\ref{chap13DNV}）。用超薄切片方法进行制样时，含有核酸的这类病毒粒子都呈一黑色的圆形颗粒，其电子密度的着色与负染色相反。
负染色的病毒粒子，白色箭头所指示的病毒粒子为无核酸的空病毒粒子，黑色箭头所指的为完整的病毒粒子
对于杆状、棒状和丝状或弹状病毒来说，通过负染色技术制样，电镜下看到的病毒粒子形态就像浅色的杆、棒或细丝。但超薄切片技术制样后，电镜下观察到的这类粒子就会呈多种形态，切片若正好是沿着病毒粒子的纵截面，则可以看到完整的杆状或棒状等形态，但很多情况下，病毒粒子会不完整，若正好切到其横截面，看到的粒子就呈圆形，若截面是斜的，则形态也就呈椭圆、斜杆状等多种形态（图\ref{chap13StickLikeVirus}）。 核酸存在与否也会与球形病毒一样，在电镜下呈不同的电子密度。
用超薄切片方法制备的杆状病毒在电镜下可呈现多个不同方向截面的结构，箭头所指的为近似的病毒横截面，呈近似圆形。照片还显示有多个病毒粒子被一个囊膜包裹。
病毒的衣壳
病毒的衣壳（Capsid）是由大量的形态亚单位--壳粒，以非共价键结合而成的，保护核酸使其不受外界的作用。壳粒（capsomere):由一种或几种化学亚单位多肽分子组成，它是电镜下能够分辨出来的形态亚单位。一般用负染色方法比超薄切片方法更容易观察到衣壳表面的这些壳粒结构，有些可看到一些突起状结构（图\ref{chap13adenovirus}）。
腺病毒的负染色照片，可看到其衣壳的壳粒结构
壳粒组装的方式决定了各壳粒之间形成的联结的性质和衣壳对称的类型。一般衣壳的对称类型有二十面体对称、螺旋对称和复合对称。
有些病毒具有单层衣壳，有些病毒具有多层衣壳。但用负染色进行电镜观察，有时很难区分病毒是否具有单层衣壳。若病毒内充满核酸，那么用负染色观察，就很难将病毒衣壳和内部的结构区分开来。若内部核酸已溢出，就很容易通过负染色方法观察到，病毒结构蛋白围成一层衣壳的结构。
电镜下还可看到有些病毒衣壳表面有明显的突起（spike），如轮状病毒，质多角体病毒等。
病毒的囊膜
病毒颗粒的囊膜是病毒在宿主细胞中复制、组装，最终从核膜、细胞质内的膜结构或细胞膜芽生成熟过程中获得的。囊膜的脂质来源于宿主细胞，而囊膜中的蛋白一般是病毒自己的基因信息编码的。有的囊膜蛋白为非糖基化外膜蛋白称为基质蛋白（matrix Protein）。有的囊膜蛋白是糖蛋白，形成囊膜的纤突，在电镜下观察这些表面的突起有时呈细小的穗状突起。这些突起的长短、排列方式等都是病毒分类的依据。如冠状病毒的囊膜突起，经负染色方法制样后，电镜下观察就像皇冠（图\ref{chap13conoravirus}）。超薄切片样品中的病毒粒子囊膜的突起，有时由于切片角度的不同会变得模糊，但经常可观察到与衣壳有明显间隔的囊膜。
冠状病毒的负染色照片，显示病毒粒子表面有像皇冠一样的囊膜突起。
电镜下还可看到有些病毒在成熟过程中会带上不同层的囊膜，如疱疹病毒，在成熟过程中就有单层、多层囊膜的变化。
病毒的囊膜环绕在病毒衣壳外面，通常病毒的囊膜结构没有衣壳那么有规则。囊膜内的衣壳呈二十面体对称或螺旋对称，但外面的囊膜却经常呈非对称形态。一个囊膜内有时包含单个病毒粒子，有些则可包含多个病毒粒子，如：昆虫的核多角体病毒等（图\ref{chap13StickLikeVirus}）。
有些病毒的囊膜会有很特别的结构，如痘病毒科所属的病毒囊膜由不规则排列的管状脂蛋白组成，使该病毒表面有很多管状突起；羊触染性脓疱病毒的囊膜表面有许多十字形交叉的带状结构。